Composant chimique de tube enroulé en acier inoxydable 310 10*1 mm, les domaines N-terminaux de la spidroïne forment des hydrogels à base de fibrilles amyloïdes et fournissent une plate-forme pour l'immobilisation des protéines.

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spécification

310 fournisseurs de tubes enroulés en acier inoxydable de 10 * 1 mm

Composition chimique

Propriétés mécaniques

Les protéines recombinantes de soie d'araignée (protéines de soie d'araignée) ont de nombreuses applications potentielles dans le développement de nouveaux biomatériaux, mais leur nature multimodale et sujette à l'agrégation les rend difficiles à obtenir et faciles à utiliser.Nous rapportons ici que les protéines de spidroïne miniatures recombinantes et, surtout, le domaine N-terminal (NT) lui-même forment rapidement des hydrogels autoportants et transparents à 37 °C.les protéines de fusion constituées de NT et de protéine fluorescente verte ou de purine nucléoside phosphorylase forment des protéines de fusion entièrement fonctionnelles.Hydrogels.Nos résultats montrent que les protéines recombinantes NT et de fusion offrent des rendements d’expression élevés et confèrent aux hydrogels des propriétés attractives telles que la transparence, la gélification sans réticulation et l’immobilisation directe de protéines actives à haute densité.
Les araignées possèdent jusqu'à sept ensembles différents de glandes à soie, chacune produisant un type spécifique de soie.Les sept espèces de soie sont composées de protéines de soie d'araignée (spidroïnes) d'une longueur d'environ 6 000 résidus et contiennent une grande région de répétition centrale entourée de domaines sphériques N et C-terminaux (NT et CT) 1,2.Le type de soie le plus étudié, l’ampoule primaire, est produit par la glande de l’ampoule primaire.Dans cette glande, une monocouche de cellules épithéliales synthétise les protéines de spidroïne et les sécrète dans la lumière de la glande, où elles sont présentes sous une forme soluble (dopage) à des concentrations extrêmement élevées (30 à 50 % p/v)3,4.L'organisation et la conformation des principales protéines de la spidroïne ampullaire dans la glande ont été débattues, mais la plupart des preuves expérimentales indiquent la présence d'une conformation hélicoïdale généralement hélicoïdale et/ou aléatoire et de structures micellaires ou lamellaires5,6,7,8,9,10.Alors que les domaines répétitifs régulent les propriétés mécaniques des fibres de soie, formant des nanocristaux de feuillet β et des structures amorphes11,12,13,14,15, les domaines terminaux régulent les fibres de soie en réponse aux conditions changeantes le long de la glande à soie16,17,18.En contrôlant la formation de la soie, 19. Les domaines terminaux sont conservés au cours de l'évolution et leur fonction peut être commune à toutes les protéines de la spirroïne 2,20,21.Lors du passage à travers la glande, le pH de la spidroïne diminue d'environ 7,6 à < 5,716 et augmente avec le cisaillement et l'étirement induits par le mouvement à travers le canal qui se rétrécit progressivement.En solution, CT est un dimère parallèle constitutif hélicoïdal α17, mais en réponse à un pH faible et à des forces de cisaillement, CT se déplie et commute les couches β16, 17, déclenchant éventuellement des couches β dans les régions répétitives de Convert 16. Les NT sont monomères sous conditions reflétant les conditions dans la lumière de la glande et médient la solubilité de la spidroïne, mais à pH réduit, la protonation d'un certain nombre de chaînes latérales d'acide carboxylique conduit à la dimérisation de la NT avec un pKa d'environ 6,5, stabilisant ainsi la NT et fixant la spidroïne en grande quantité. quantités.réseaux16,18.Ainsi, NT joue un rôle clé dans la formation des filaments, passant d’un monomère dans le revêtement à un dimère dans la fibre23,24,25.La NT reste hautement soluble et hélicoïdale dans toutes les conditions étudiées à ce jour16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ce qui a inspiré son développement en tant que marqueur améliorant la solubilité pour la production de protéines hétérologues.
La mini protéine de soie d'araignée recombinante, composée d'un NT, d'une région de répétition courte, d'un CT et d'une étiquette His6 (His-NT2RepCT) pour la purification, est aussi soluble dans un tampon aqueux que la protéine de soie d'araignée native et imite les caractéristiques natives importantes de l'araignée de soie. .couverture 25.31.His-NT2RepCT peut être filé en fibres continues à l'aide d'une machine biomimétique dans laquelle un revêtement soluble de pH 8 est extrudé dans un bain-marie de pH 525,32,33,34,35.La fermentation en bioréacteur d'E. coli exprimant His-NT2RepCT et le post-traitement ultérieur ont abouti à un rendement > 14 g/L après purification.Le rendement élevé, la solubilité élevée et la réponse adéquate de His-NT2RepCT aux conditions acides sont tous attribués à NT23, 25, 34.
Nous rapportons ici la formation rapide d’hydrogels transparents à partir de protéines de spirroïne recombinantes, y compris NT seule, en incubant une solution protéique à 37 °C.En utilisant la fluorescence de la thioflavine T (ThT), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie électronique à transmission (TEM), nous avons constaté que les protéines NT et microaraignées subissent une transformation structurelle en feuillets β et en fibrilles de type amyloïde. lorsque les gels se forment.De plus, les protéines de fusion de NT et de la protéine fluorescente verte (GFP) ou de la purine nucléoside phosphorylase (PNP) forment des hydrogels avec des fragments de fusion entièrement fonctionnels.L’expression à haut débit chez des hôtes hétérologues, associée à la formation rapide d’hydrogels dans des conditions physiologiques, ouvre la possibilité d’une production rentable d’hydrogels dotés de fonctions techniques.
Contrairement à la plupart des protéines de spirroïne recombinantes rapportées36, His-NT2RepCT est stable dans un tampon Tris-HCl à pH 8 et peut être concentrée jusqu'à 500 mg/mL sans précipitation25.Par conséquent, nous avons été surpris de constater que cette protéine forme rapidement des hydrogels optiquement clairs et autoportants lorsqu'elle est incubée à 37 ° C (Fig. 1b-d).D'autres études ont montré que la gélification de His-NT2RepCT se produisait sur une large plage de concentrations de protéines (10 à 300 mg/mL) et que cette concentration était inversement corrélée au temps de gélification (Fig. 1c et Fig. 1 supplémentaire).Pour découvrir quelles parties de His-NT2RepCT interviennent dans la formation d'hydrogel, nous avons ensuite examiné chaque domaine individuellement et dans diverses combinaisons à l'aide d'un test d'inversion en flacon (Figure 1a, b).Toutes les fractions testées de spidroïne recombinante ont formé des gels (à une concentration en protéines de 300 mg/mL) en moins d'une heure, à l'exception du 2Rep précipité (Fig. 1b).Ceci suggère que NT et CT seuls, en combinaison, ou associés à des répétitions, peuvent gélifier à 37°C et que l'étiquette His6 n'affecte pas ce processus de manière significative.Étant donné l’idée courante selon laquelle la NT est une protéine hautement soluble et stable, et que des rapports antérieurs sur des hydrogels de spidroïne recombinantes ont attribué les effets de gélification à des changements conformationnels dans des régions répétées et/ou des CT, la NT elle-même pourrait le faire.La découverte de la gélification était inattendue.Tableau supplémentaire 1) 37, 38, 39. De manière remarquable, NT s'est déjà gélifié en 10 minutes à une concentration ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Des expériences d'inversion de flacons avec différentes concentrations de NT ont montré qu'à > 50 mg/mL, la solution de NT gélifiait plus rapidement que His-NT2RepCT à la concentration correspondante (p/v, Figure 1c).
Représentation schématique de diverses constructions de spidroïne étudiées dans ce travail.b Temps de gel à 37 °C pour diverses protéines de spirroïne recombinantes (300 mg/mL) vérifié en retournant le flacon.Gel CT immédiatement sans incubation (<300 mg/mL), 2Rep précipite (300 mg/mL, échelle 5 mm).c Temps de gel de His-NT2RepCT et NT aux concentrations de protéines indiquées à 37°C.d Photographies des hydrogels His-NT2RepCT et NT avec respectivement l'araignée et la lettre « NT » imprimées en dessous (tous deux 200 mg/mL, barre d'échelle 5 mm).
Les hydrogels formés par diverses protéines de spirroïne recombinantes ont des couleurs légèrement différentes et l'observation à l'œil nu montre différents degrés de transparence (Fig. 1b).Les gels NT sont exceptionnellement clairs tandis que les autres gels deviennent opaques.Les gels His-NT2RepCT et NT coulés dans des tubes cylindriques ont pu être retirés du moule intacts (Fig. 1d).
Pour tester si les revêtements naturels de soie d'araignée gélifient dans des conditions qui provoquent maintenant la gélification des protéines recombinantes de la spidroïne, des revêtements ont été collectés dans la grande glande ampoule de l'araignée pont suédoise (Larinioides sclopetarius).Les revêtements ont été stockés dans un tampon Tris-HCl 20 mM à 50 mg/mL (sur la base du poids sec mesuré), mais aucune gélification n'a été observée au cours des 21 jours d'incubation à 37 °C (Figure 2a supplémentaire).
Pour quantifier ces gels, des mesures rhéologiques peuvent être utilisées pour étudier le processus de gélification et déterminer les propriétés mécaniques globales.En particulier, le contrôle du module de stockage (élasticité) à des températures élevées peut fournir des informations sur la température de gélification ainsi que sur les propriétés viscoélastiques du revêtement.Des expériences d'augmentation de la température (à raison de 1 °C/min à 25-45 °C, basées sur des études antérieures utilisant des solutions mères de soie naturelle)40,41 ont montré que les modules de stockage des solutions His-NT2RepCT et NT augmentaient avec l'augmentation de la température.a été augmenté (Fig. 2 et Fig. 3 supplémentaire).Notamment, le module NT a commencé à croître à une température plus basse que celle de His-NT2RepCT, ce qui correspond au temps de gel plus rapide observé lorsque NT était directement incubé avec His-NT2RepCT à 37 °C (Figure 1).Après une baisse ultérieure de la température, le module de stockage n'est pas revenu à des valeurs inférieures et est resté au-dessus du module de perte (voir Fig. 3 supplémentaire), indiquant une gélification stable thermiquement irréversible.Après gélification, le module d'élasticité final variait de 15 à 330 kPa pour les hydrogels His-NT2RepCT à une concentration de 100 à 500 mg/mL, et le module d'élasticité final pour les hydrogels NT (100 à 500 mg/mL) variait de 2 à 1 400. kPa (Fig. 2 et données complètes de la rampe) voir Fig. 3 supplémentaire).
a Changement de température lors des mesures de His-NT2RepCT (300 mg/mL) et b NT (300 mg/mL) avec agitation.Les flèches indiquent la tendance de la température et l'ombrage plus clair des données du module de stockage représente des tests à des valeurs de couple de l'instrument inférieures à celles spécifiées par le fabricant, ce qui est à l'origine de l'augmentation du bruit.c Accumulation de module terminal de His-NT2RepCT et NT après une température élevée (100, 300 et 500 mg/mL).Toutes les lectures du module sont prises à une fréquence de 0,1 Hz.
En tant que méthode potentielle pour étudier les changements conformationnels associés à la gélification, nous avons enregistré les spectres FTIR de His-NT2RepCT et NT avant et après la gélification à 37 ° C (Figure 3a, b).Comme prévu, les spectres des solutions His-NT2RepCT et NT correspondaient à des protéines présentant une structure secondaire en hélice α/bobine aléatoire, avec une bande prononcée à 1 645 cm-1.Pour les deux hydrogels, la gélification a entraîné la formation de deux bras dans la bande médiane I à environ 1 617 cm-1 et 1 695 cm-1 (Fig. 3a, b), indiquant la formation de structures de feuillet β antiparallèles.Ces changements peuvent également être clairement observés dans les spectres respectifs de dérivée seconde et de gélification par différence (Fig. 4b supplémentaire).Les deux bandes de la couche β NT étaient plus prononcées que celles de His-NT2RepCT, ce qui indique que la teneur totale en bandes de la couche β dans l'hydrogel NT était supérieure à celle de l'hydrogel NT2RepCT.
un spectre d'absorption FTIR de His-NT2RepCT et b NT (tous deux à 500 mg/mL) avant (solution) et après (gel) incubation à 37°C.c Images TEM de gels NT2RepCT à 50 mg/ml remis en suspension et d NT.Barre d'échelle 200 nm.e Diamètres de fibres des hydrogels His-NT2RepCT et NT.n = 100 fibrilles mesurées, p < 0,0001.Les barres d'erreur montrent l'écart type.Le centre des barres d'erreur est la moyenne.Un test t non apparié (bilatéral) a été utilisé pour l'analyse statistique.f Fluorescence ThT de diverses protéines de spirroïne recombinantes (100 mg/mL) à 37 °C sans agitation.g NT (100 mg/mL) expériences d’inoculation à partir de 100 mg/mL de gel NT avec 0 %, 5 %, 10 % et 20 % de graines.
L'analyse du gel par microscopie électronique à transmission (TEM) a montré que l'hydrogel est constitué de fibrilles de type amyloïde (figures 3c, 3d).Les fibrilles formées par NT étaient allongées (5 à 12 nm de diamètre) et non ramifiées, tandis que les fibrilles His-NT2RepCT étaient plus courtes et significativement plus larges (7 à 16 nm) (Fig. 3e).Ces résultats nous ont permis de suivre la cinétique de la fibrose grâce au dosage de la thioflavine T (ThT).Pour toutes les protéines de spirroïne recombinantes, le signal fluorescent a augmenté lorsque les échantillons ont été incubés à 37 ° C (Fig. 3f, Fig. 5a supplémentaire).Conformément à cette découverte, l'examen microscopique de NT et His-NT2RepCT dans des conditions de gélification a révélé une augmentation uniforme de la fluorescence ThT sans accumulation locale notable d'agrégats ThT-positifs (Fig. Supplémentaire 5b, c).La formation de fibrilles ThT-positives ne s'est pas accompagnée d'une augmentation de la turbidité des NT et His-NTCT (Fig. 5d supplémentaire), ce qui signifie qu'un réseau de fibrilles dans le gel pourrait se former sans compromettre la clarté du gel.L'ensemencement en ajoutant de petites quantités de fibrilles préformées peut accélérer considérablement la formation de fibrilles de certains amyloïdes42,43,44, mais en ajoutant 5 %, 10 % ou 20 % (p/p) de NT à une solution d'hydrocoagulants NT.effet d'ensemencement (Fig. 3g).Cela est peut-être dû au fait que les fibrilles contenues dans l’hydrogel sont relativement fixes et ne peuvent pas être utilisées comme graines.
Le comportement inattendu des protéines de spirroïne recombinantes à haute température a incité à d'autres études de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) pour identifier les changements conformationnels associés à la formation de gel.Les spectres RMN des solutions His-NT2RepCT enregistrés au fil du temps à 37 ° C ont montré que CT était encore partiellement plié, alors que les signaux NT et 2Rep avaient disparu (Fig. 4a), ce qui suggère que c'était principalement NT et 2Rep qui contrôlaient partiellement la formation de His-NT2RepCT. Hydrogel NT2RepCT.Le signal CT a également été atténué à 20 % de son intensité d’origine, ce qui suggère que le CT est également principalement fixé et incorporé dans la structure de l’hydrogel.Pour une partie plus petite du CT, qui est aussi mobile que dans l'échantillon préincubé et donc observée par RMN en solution, les spectres manquent de signaux pour les 10 premiers résidus structurés, probablement en raison d'une immobilisation difficile de la partie attachée de His-NT2Rep.Les spectres RMN de l'état des hydrogels -NT2RepCT ont révélé la présence prédominante d'hélices α et de couches β et, dans une moindre mesure, la conformation en bobine aléatoire (Fig. 4b).L'analyse du déplacement chimique des résidus méthionine présents uniquement dans NT a montré que ce domaine avait été converti en une structure en feuillet β.Les spectres de NT en solution en fonction du temps ont montré une diminution uniforme de l'intensité du signal (Fig. 4c) et la RMN à l'état solide des hydrogels de NT a montré que la plupart des résidus de NT étaient convertis en structures de feuillet β (Fig. 4d).La conformation de 2Rep n'a pas pu être déterminée séparément en raison de sa tendance à l'agrégation.Cependant, les spectres RMN à l'état solide des hydrogels NTCT et His-NT2RepCT semblaient très similaires (Fig. 4b; Fig. 6b supplémentaire), suggérant que 2Rep contribuait peu à la partie structurelle de l'hydrogel His-NT2RepCT.Pour les hydrogels CT, il existe des hélices α, des feuillets β et des structures secondaires hélicoïdales aléatoires (Fig. 6d supplémentaire).Cela suggère que certaines parties du CT restent des hélices α tandis que d'autres deviennent des feuillets β.Ainsi, les résultats de la spectroscopie RMN suggèrent que NT est important pour la formation d'hydrogel et se transforme également en conformation en feuillet β lors de la fusion avec 2Rep et CT.Conformément à cela, nous avons récemment découvert que des fermetures éclair spatiales amyloïdes se formaient probablement dans les cinq hélices du domaine NT, et l'algorithme de Waltz avait prédit une région amyloïdogène dans l'hélice 1 (Fig. 4e).
Spectres 2D de la solution 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT avant (bleu) et 19 heures après l'incubation (rouge) à 37°C.Les pics croisés individuels dans le spectre rouge et F24, G136, polyA dans le spectre bleu sont désignés par des symboles d'acides aminés à une seule lettre et des numéros de résidus.Les encadrés montrent la dépendance de l'intensité du signal en fonction du temps pour les résidus sélectionnés des domaines NT, 2Rep et CT.b Spectres de radiofréquence à l'état solide (RFDR) des hydrogels His-NT2RepCT.Les corrélations des résidus Cα/Cβ observées dans les spectres RFDR ont été déterminées par comparaison avec les déplacements chimiques des peptides modèles et les valeurs dérivées des statistiques82,83 et de leurs structures secondaires.SSB – bande latérale rotative.c Spectres unidimensionnels de la solution 15N-HSQC 10 mg/mL NT pendant l'incubation à 37 °C pendant 36 heures.L'encart montre l'intensité volumétrique en fonction du temps.d Spectres RFDR à l’état solide des hydrogels NT.Les corrélations des résidus Cα/Cβ et de leurs structures secondaires observées dans les spectres RFDR sont indiquées.e Basé sur le profil de propension à la fibrillation NT45.79 de la base de données Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).L’énergie Rosetta de la fenêtre spatiale de déplacement de l’hexapeptide est indiquée en kcal/mol.Les barres rouges désignent les hexapeptides ayant une forte propension à la fibrose (énergie de Rosetta inférieure à -23 kcal/mol ; en dessous de la ligne pointillée).Les barres vertes indiquent les fragments dont les énergies de Rosette sont supérieures au seuil et donc moins susceptibles de former des fermetures éclair stériques.Les fragments contenant de la proline ont été exclus de l'analyse (sans colonnes).Les carrés indiquent les zones d'amylose prédites par l'algorithme Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).La séquence des résidus d'acides aminés de NT est en haut et les types de résidus trouvés dans la structure secondaire β (déterminés par spectroscopie RMN du solide) sont indiqués en rouge.Les positions des cinq hélices α NT sont désignées par (H1-H5)28.
À un pH <6,5, le HT se dimérise et résiste à la dénaturation induite par la chaleur ou l'urée18.Pour élucider comment la dimérisation et la stabilité du NT affectent la gélification, des solutions contenant 100 mg/ml de NT ont été contrôlées à pH 8, 7 et 6 à l'aide du test d'inversion du flacon.Les échantillons NT incubés à pH 8 et 7 se sont gélifiés après 30 minutes à 37 ° C, mais le gel à pH 8 est resté clair, tandis que le gel à pH 7 a montré un précipité visible (figure 5a).En revanche, une solution contenant du HT à pH 6 ne forme pas de gel et un gros précipité peut être observé après 20 minutes à 37°C.Ceci suggère que les dimères eux-mêmes et/ou leur stabilité supérieure à celle des monomères empêchent la gélification.La formation d'un précipité pour le NT à pH 7 et 6 n'était pas attendue, car il a été rapporté que le NT est soluble à 200 mg/ml27, se replie facilement après dénaturation thermique et conserve également une hélice α à des valeurs inférieures de pH 18. Une explication probable de ces écarts est que les expériences rapportées précédemment ont été réalisées à température ambiante ou en dessous, ou à des concentrations de protéines relativement faibles16,18,19.
Test d'inversion en flacon NT (100 mg/mL) à pH 8, 7, 6 et NaCl 154 mM (pH 8) après incubation à 37°C.b Spectres NT CD avec et sans NaF 154 mM et NaCl 154 mM, respectivement.L'ellipticité molaire à 222 nm est convertie en proportion de plis naturels.c Test d'inversion NT (100 mg/mL) NT* (37 °C et 60 °C), NTA72R (37 °C) et His-NT-L6 (37 °C et 60 °C).d Spectres CD des mutants NT NT*, NTA72R et His-NT-L6.L'ellipticité molaire à 222 nm est convertie en proportion de plis naturels.e Test d'inversion de NTFlSp, NTMiSp et NTMiSp réduit (100 mg/mL).Barre d'échelle 5 mm.f Spectres CD de NT, NTFlSp, NTMiSp et NTMiSp réduit.L'ellipticité molaire à 222 nm est convertie en proportion de plis naturels.Les spectres NT complets à 25 ° C et 95 ° C sont présentés dans la Figure supplémentaire 8.
La concentration physiologique en sel détermine les interactions électrostatiques entre les sous-unités NT et la dimérisation du transfert de NT vers un pH inférieur de 18.Nous avons constaté que la présence de 154 mM de NaCl et de NaF inhibait effectivement la gélification, respectivement (Fig. 5a, b; Fig. 2b supplémentaire) et que ces sels augmentaient la stabilité thermique des monomères NT (Fig. 5b, Fig. 8 supplémentaire). .Cela suggère également que l’amélioration de la stabilité, plutôt que la dimérisation, empêche la formation de gel.
Pour explorer davantage le rôle de la dimérisation et de la stabilité des protéines dans la gélification, nous avons utilisé deux mutants, NT* et NTA72R, qui restent également monomères à faible pH de 28,30.NT* est un mutant à double inversion de charge dans lequel la distribution apparente de charge dipolaire du monomère est aplatie, ce qui empêche la dimérisation et augmente considérablement la stabilité du monomère.NTA72R est un dipôle chargé, mais Ala substitué par Arg est situé à la limite du dimère, de sorte que les mutations interfèrent avec les interactions de sous-unités nécessaires à la dimérisation.Lors de l'incubation à 37 ° C, NT * n'a pas formé d'hydrogel, tandis que NTA72R a formé un gel opaque pendant 15 minutes (figure 5c).Étant donné que NT * et NTA72R ne peuvent pas se dimériser mais diffèrent par leur stabilité des monomères (Fig. 5d), ces résultats suggèrent fortement qu'une stabilité thermodynamique élevée empêche NT de se gélifier.Ceci est également corroboré par le fait que HT* forme un gel lorsqu'il est instable à haute température (après 8 min à 60°C ; Fig. 5c).Il a déjà été démontré que la teneur élevée en méthionine du NT liquéfie son repliement naturel et que six substituts Met en Leu (appelés ici His-NT-L6) stabilisent fortement le monomère NT46.En partant de l'hypothèse selon laquelle une flexibilité structurelle est requise pour la formation du gel NT, nous avons constaté que le mutant stable His-NT-L6 ne gélifiait pas à 37 ° C (Figure 5c, d).Cependant, His-NT-L6 a également formé un gel lors d'une incubation à 60 ° C pendant 60 min (Fig. 5c).
La capacité du NT à se transformer en structures de feuillets β et à former des hydrogels semble s'appliquer à certains domaines NT de la spidroïne, mais pas à tous.Les NT de différents types de soie et espèces d'araignées, Trichonephila clavipes (NTFlSp), ont formé des gels malgré leur teneur relativement faible en méthionine et leur stabilité thermique élevée (Fig. 5e, f et Tableau supplémentaire 2).En revanche, la NT de la petite protéine ampullaire spirroïne d'Araneus ventricosus (NTMiSp) présentant une faible stabilité thermique et une teneur élevée en méthionine n'a pas formé d'hydrogels (Tableau supplémentaire 2 et Fig. 5e, f).Cette dernière peut être associée à la présence de liaisons disulfure intramoléculaires29,47.De manière cohérente, lorsque les liaisons disulfure du NTMiSp étaient réduites, celui-ci formait un hydrogel après une incubation à 37 ° C pendant 10 min (figure 5e).En conclusion, il convient de noter que la flexibilité structurelle est un critère important, mais pas le seul, pour la formation d’un gel à partir de NT.Un autre facteur qui peut être pertinent est la propension à former des fibrilles amyloïdes, et l'analyse avec la base de données Zipper et l'algorithme Waltz a montré une corrélation entre la capacité à former des gels et la présence de régions amyloïdogènes, ainsi que l'étendue des régions prédites. pour former des fermetures éclair stériques.Il y avait une corrélation (Tableau supplémentaire 2 et Fig. 9 supplémentaire).
La capacité du NT à former des fibrilles et des gels dans des conditions favorables nous a amenés à émettre l'hypothèse que les fusions du NT avec d'autres fragments protéiques peuvent toujours former des gels dotés de toutes les fonctions de partenaires de fusion.Pour tester cela, nous avons introduit la protéine fluorescente verte (GFP) et la purine nucléoside phosphorylase (PNP) à l'extrémité C-terminale du NT, respectivement.Les protéines de fusion résultantes ont été exprimées dans E. coli avec des rendements finaux très élevés (150 mg/L et 256 mg/L de cultures en flacon agité pour His-NT-GFP et His-NT-PNP, respectivement), conformément à ce qui a été montré. pour Autres protéines fusionnées à NT Réf.30. Les protéines de fusion His-NT-GFP (300 mg/mL) et His-NT-PNP (100 mg/mL) ont formé des gels après 2 heures et 6,5 heures à 37°C et, surtout, la fraction GFP est restée inchangée.observé après la gélification, avec> 70% de l'intensité de fluorescence initiale restant après la gélification (Fig. 6a).Pour mesurer l'activité PNP dans les solutions et gels his-NT-PNP, nous avons dû diluer la protéine de fusion avec NT car l'activité enzymatique de la préparation pure était en dehors de la plage de détection du test à des concentrations gélifiantes.Le gel formé avec un mélange contenant 0,01 mg/mL de His-NT-PNP et 100 mg/mL de NT a conservé 65 % de l'activité enzymatique initiale des échantillons préincubés (Fig. 6b).Le gel est resté intact pendant la mesure (Fig. 10 supplémentaire).
a Intensité relative de fluorescence avant et après gélification de His-NT-GFP (300 mg/mL) et flacon inversé contenant l'hydrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) sous lumière visible et UV.Les points montrent les mesures individuelles (n = 3), les barres d'erreur montrent l'écart type.La valeur moyenne est affichée au centre des barres d'erreur.b L'activité PNP a été obtenue par analyse fluorométrique en utilisant des solutions et des gels constitués de NT (100 mg/ml) et d'un mélange contenant 0,01 mg/ml de his-NT-PNP et 100 mg/ml de nouveaux dollars de Taiwan.L'encart montre un flacon inversé contenant un hydrogel contenant His-NT-PNP (barre d'échelle de 5 mm).
Nous rapportons ici la formation d’hydrogels à partir de NT et d’autres protéines de spirroïne recombinantes en incubant une solution protéique à 37°C (Figure 1).Nous montrons que la gélification est associée à la transformation des hélices α en couches β et à la formation de fibrilles de type amyloïde (Fig. 3 et 4).Cette découverte est surprenante dans la mesure où les NT sont des faisceaux globulaires enroulés de cinq hélices connus pour leur solubilité extrêmement élevée et leur grande stabilité à des concentrations > 200 mg/mL à 4°C pendant plusieurs jours27.De plus, les NT se replient facilement après dénaturation thermique à de faibles concentrations de protéines en µM.Selon nos résultats, la formation de fibrilles nécessite une combinaison d'une concentration en protéines > 10 mg/mL et d'une température légèrement élevée (Fig. 1).Ceci est cohérent avec l'idée selon laquelle des fibrilles amyloïdes peuvent se former à partir de protéines repliées de manière globulaire qui sont dans un état partiellement déplié en raison de fluctuations thermiques dans des conditions physiologiques 48 .Des exemples de protéines qui subissent cette conversion comprennent l'insuline49,50, la β2-microglobuline, la transthyrétine et le lysozyme51,52,53.Bien que NT soit une hélice α dans son état natif, environ 65 % de la chaîne polypeptidique est compatible avec la formation d'une fermeture éclair stérique (Fig. 4e) 45 .Étant donné que le monomère est dynamiquement mobile46, il peut exposer ces régions amyloïdogènes potentielles à des températures modérément élevées et, à des concentrations élevées de protéines totales, il peut atteindre une concentration critique pour la formation de fibrilles amyloïdes54.En suivant ce raisonnement, nous avons trouvé une corrélation négative entre la concentration en spidroïne et le temps de gélification (Fig. 1c), et si la conformation monomère NT est stabilisée soit par des mutations (NT*, His-NT-L6), soit par l'ajout de sel, elle peut empêcher la formation d'hydrogels (Fig. 5).
Dans la plupart des cas, les fibrilles amyloïdes disparaissent de la solution sous forme de précipité, mais dans certaines conditions, elles peuvent former des hydrogels55,56,57.Les fibrilles formant un hydrogel ont généralement un rapport d'aspect élevé et forment des réseaux tridimensionnels stables par enchevêtrement moléculaire,55,58 ce qui concorde avec nos résultats.Pour la formation d'hydrogels in vitro, les protéines sont souvent entièrement ou partiellement dépliées, par exemple par exposition à des solvants organiques, à une température élevée (70 à 90 °C) et/ou à un pH faible (1,5 à 3,0)59,60,61,62.Les hydrogels de spidroïne décrits ici ne nécessitent pas de traitement rigoureux ni d’agents de réticulation pour stabiliser les hydrogels.
Il a déjà été rapporté que les répétitions et les QD de la spidroïne, qui semblent subir une commutation de feuille β pendant le filage de la soie, forment des hydrogels.Par rapport à nos résultats, les temps d'incubation et/ou les températures d'incubation étaient respectivement significativement plus longs ou plus élevés, et les hydrogels résultants étaient souvent opaques (Figure 7 et Tableau supplémentaire 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. En plus des temps de gel rapides, les hydrogels NT > 300 mg/mL (30 %) ont surpassé tous les autres hydrogels de protéines de soie d'araignée recombinantes décrits, ainsi que les hydrogels naturels tels que la gélatine, l'alginate (2 %), l'agar (0,5 %). ) et du collagène.(0,6%) (Figure 7 et tableaux supplémentaires 1 et 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Le temps de gel et le module d’élasticité des hydrogels de cette étude ont été comparés à d’autres hydrogels à base de spidroïne et à des hydrogels naturels sélectionnés.Les références sont données avec une description des conditions de gélification.APS Persulfate d'ammonium, température ambiante.Données 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Les araignées semblent avoir développé des moyens pour empêcher la spirroïne de se gélifier pendant le stockage.Malgré la forte concentration de protéines dans la glande à soie, la grande région de répétition associée au domaine terminal signifie que la concentration apparente de NT et CT dans la glande correspond à environ 10-20 mg/ml, à la limite de cette étude.nécessaire à la formation d’hydrogel observée in vitro.De plus, des concentrations similaires de sels 16 ont stabilisé le NT, comme dans les glandes à soie (Fig. 5b).La conformation NT a été étudiée dans le cytosol d'E. coli et s'est révélée plus étroitement repliée que lors d'un examen in vitro, ce qui indique en outre que le sel ou d'autres facteurs empêchent son agrégation in vivo.Cependant, la capacité des NT à se transformer en fibrilles à feuillets β peut être importante pour la formation de filaments et devrait être étudiée dans des études futures.
En plus des nouveaux aspects de la formation de fibrilles et d'hydrogels de type NT-amyloïde observés dans cette étude, nous montrons également que ce phénomène peut avoir des applications biotechnologiques et biomédicales (Fig. 8).En guise de preuve de concept, nous avons combiné NT avec GFP ou PNP et montré que la protéine de fusion forme également des hydrogels lorsqu'elle est incubée à 37 ° C et que les fractions GFP et PNP conservent largement leur activité après gélification (Figure 6).Les nucléosides phosphorylases sont d'importants catalyseurs de synthèse d'analogues nucléosidiques75, ce qui rend notre découverte pertinente pour l'industrie biopharmaceutique.Le concept d’expression de protéines de fusion qui forment des hydrogels transparents dans des conditions favorables permet la création d’hydrogels fonctionnalisés dotés de propriétés favorables pour un large éventail d’applications telles que l’immobilisation d’enzymes, la libération contrôlée de médicaments et l’ingénierie tissulaire.De plus, NT et NT* sont des marqueurs d’expression efficaces30, ce qui signifie que NT et ses variantes peuvent être utilisées pour la production à haut débit de protéines de fusion solubles et la création ultérieure de protéines cibles immobilisées dans des hydrogels 3D.
Le NT est soluble, α-hélicoïdal et stable à faibles concentrations (µM) et à 37°C.À la même température, mais à des concentrations croissantes (> 10 mg/ml), le NT forme des gels constitués de fibrilles de type amyloïde.Les protéines de fusion NT forment également des gels fibrillaires avec des fragments de fusion entièrement fonctionnels, permettant à diverses protéines d'être immobilisées dans des hydrogels 3D à l'aide de NT.En bas : NT (PDB : 4FBS) et illustrations de réseaux de fibres et de structures protéiques associées (supposées et non dessinées à l'échelle, GFP PDB : 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb ; PNP PDB : 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Les constructions (voir le tableau supplémentaire 4 pour une liste complète comprenant les séquences d'acides aminés) ont été clonées dans le plasmide pT7 et transformées dans E. coli BL21 (DE3).E. coli contenant des plasmides modifiés ont été inoculés dans un bouillon Luria supplémenté en kanamycine (70 mg/l) et cultivés pendant une nuit à 30°C et 250 tr/min.La culture a ensuite été inoculée au 1/100 dans un milieu LB contenant de la kanamycine et cultivée à 30°C et 110 tr/min jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,8.Pour les études RMN, les bactéries ont été cultivées dans un milieu minimal M9 contenant 2 g de D-glucose 13C (Aldrich) et 1 g de chlorure d'ammonium 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) pour le marquage des protéines avec des isotopes.Abaisser la température à 20 degrés Celsius et induire l’expression des protéines avec 0,15 mM d’isopropylthiogalactopyranoside (concentration finale).Après une nuit d'expression des protéines, les cellules ont été récoltées à 7 278 x g, 4 ° C pendant 20 min.Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du Tris-HCl 20 mM, pH 8, et congelés jusqu'à leur utilisation ultérieure.Les cellules décongelées ont été lysées à l'aide d'un perturbateur cellulaire (machines de la série TS, Constant Systems Limited, Angleterre) à 30 kPa.Ensuite, les lysats ont été centrifugés à 25 000 g pendant 30 minutes à 4°C.Pour NTMiSp, le culot a ensuite été remis en suspension dans 2 M d'urée, 20 mM Tris-HCl, pH 8, et soniqué pendant 2 min (2 s marche/arrêt, 65 %), puis centrifugé à nouveau à 25 000 xg, 4°C dans les 24 heures. 30 minutes.Le surnageant a été chargé sur une colonne Ni-NTA, lavé avec du Tris-HCl 20 mM, de l'imidazole 2 mM, pH 8, et enfin la protéine a été éluée avec du Tris-HCl 20 mM, de l'imidazole 200 mM, pH 8. Pour générer NT2RepCT et NTCT, la digestion par la thrombine introduit le site (ThrCleav) entre His et NT.Des sites de clivage de la thrombine sont également présents dans His-NT-ThrCleav-2Rep (produit 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produit NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produit CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produit NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produit NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produit NTF1Sp) et His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produit NTMiSp).Les constructions ont été digérées avec de la thrombine (1 : 1 000) et dialysées pendant une nuit à 4 °C avec du Tris-HCl 20 mM, pH 8, en utilisant une membrane de dialyse Spectra/Por avec un seuil de poids moléculaire de 6 à 8 kDa.Après dialyse, la solution est chargée sur une colonne Ni-NTA et l'effluent contenant la protéine d'intérêt est collecté.Les concentrations de protéines ont été déterminées en mesurant l'absorbance UV à 280 nm en utilisant le coefficient d'extinction de chaque protéine, à l'exception de NTF1Sp, qui utilisait le test de Bradford selon le protocole du fabricant.La pureté a été déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (4 à 20 %) et coloration au bleu brillant de Coomassie.Les protéines ont été concentrées à l'aide de filtres centrifuges (VivaSpin 20, GE Healthcare) à 4 000 xg avec un seuil de poids moléculaire de 10 kDa en cycles de 20 minutes.
Décongeler la solution protéique et pipeter soigneusement 150 µl dans un flacon à septum transparent de 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Les tubes ont été bouchés et scellés avec du parafilm pour éviter l'évaporation.Les échantillons (n ​​= 3) ont été incubés à 37°C ou 60°C et périodiquement inversés pour observer la gélification.Les échantillons qui ne gélifiaient pas ont été incubés pendant au moins une semaine.Réduisez les liaisons disulfure NTMiSp avec 10 mM de DTT par 10 µM de protéine.Pour analyser la gélification des revêtements naturels de soie d'araignée, l'araignée pont suédoise a été coupée, les deux glandes ampulées principales ont été placées dans 200 µl de tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 et coupées pour permettre au revêtement de se séparer des glandes..Le contenu des glandes est dissous dans un tampon, 50 µl pour la détermination du poids sec (par incubation de flacons ouverts à 60 °C jusqu'à poids constant) et 150 µl pour la gélification à 37 °C.
La géométrie/outil de mesure est réalisé en acier inoxydable à l'aide d'une plaque parallèle d'un diamètre supérieur de 20 mm et d'un écart de 0,5 mm.Chauffer l’échantillon de 25 °C à 45 °C et revenir à 25 °C à raison de 1 °C par minute à l’aide d’une plaque Peltier inférieure en acier inoxydable.Des mesures vibratoires ont été effectuées à une fréquence de 0,1 Hz et dans la région viscoélastique linéaire du matériau à une déformation de 5 % et 0,5 % pour des échantillons de 100 mg/mL et 300 à 500 mg/mL, respectivement.Utilisez une chambre humide personnalisée pour éviter l’évaporation.Les données ont été analysées à l'aide de Prism 9.
Pour collecter des spectres infrarouges (IR) à température ambiante de 800 à 3900 cm–1.Le dispositif ATR, ainsi que le trajet de la lumière à travers le spectromètre, sont purgés avec de l'air sec filtré avant et pendant l'expérience.Des solutions (500 mg/mL pour minimiser les pics d'absorption d'eau dans les spectres) ont été pipetées sur les cristaux et des gels (500 mg/mL) ont été formés avant la mesure, puis transférés aux cristaux (n = 3).1 000 scans ont été enregistrés avec une résolution de 2 cm-1 et un rapport cyclique nul de 2. La dérivée seconde a été calculée à l'aide d'OPUS (Bruker) en utilisant une plage de lissage de neuf points.Les spectres ont été normalisés dans la même région d'intégration entre 1720 et 1580 cm-1 à l'aide de F. Menges « Spectragryph – Optical Spectroscopy Software ».En spectroscopie ATR-IR, la profondeur de pénétration d'un faisceau infrarouge dans un échantillon dépend du nombre d'onde, ce qui entraîne une absorption plus forte aux nombres d'onde inférieurs qu'aux nombres d'onde plus élevés.Ces effets n'ont pas été corrigés pour les spectres représentés sur les Fig.3 car ils sont très petits (Fig. 4 supplémentaire).Les spectres corrigés pour cette figure ont été calculés à l'aide du logiciel Bruker OPUS.
En principe, une quantification complète des conformations protéiques est possible après une déconvolution fiable des composants au sein du pic amide I.Cependant, certains obstacles surviennent dans la pratique.Le bruit dans le spectre peut apparaître sous forme de (faux) pics lors de la déconvolution.De plus, le pic dû à la flexion de l’eau coïncide avec la position du pic de l’amide I et peut avoir une ampleur similaire pour les échantillons contenant une grande quantité d’eau, comme le gel aqueux étudié ici.Par conséquent, nous n’avons pas tenté de décomposer complètement le pic d’amide I et nos observations ne doivent être considérées qu’à l’appui d’autres méthodes telles que la spectroscopie RMN.
Des solutions de 50 mg/ml de NT et de His-NT2RepCT ont été gélifiées pendant une nuit à 37°C.L'hydrogel a ensuite été dilué avec du Tris-HCl 20 mM (pH 8) jusqu'à une concentration de 12,5 mg/ml, bien secoué et pipeté pour briser le gel.Ensuite, l'hydrogel a été dilué 10 fois avec du Tris-HCl 20 mM (pH 8), 5 µl de l'échantillon ont été appliqués sur une grille de cuivre recouverte de formvar et l'échantillon en excès a été retiré avec du papier buvard.Les échantillons ont été lavés deux fois avec 5 µl d'eau MilliQ et colorés avec du formiate d'uranyle à 1% pendant 5 minutes.Enlevez l'excédent de tache avec du papier absorbant, puis séchez le treillis à l'air.L'imagerie a été réalisée sur ces grilles à l'aide d'un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN fonctionnant à 100 kV.Les images ont été enregistrées à des grossissements x 26 500 et x 43 000 à l'aide d'une caméra CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Allemagne).Pour chaque échantillon (n = 1), 10 à 15 images ont été enregistrées.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) a été utilisé pour l'analyse d'images et la mesure des diamètres de fibres (n = 100, différentes fibres).Prism 9 a été utilisé pour effectuer des tests t non appariés (bilatéraux).Les fibrilles moyennes His-NT2RepCT et NT étaient respectivement de 11,43 (SD 2,035) et 7,67 (SD 1,389) nm.L'intervalle de confiance (95 %) est compris entre -4,246 et -3,275.degrés de liberté = 198, p < 0,0001.
80 µl d'échantillons liquides contenant 10 µM de thioflavine T (ThT) ont été mesurés en triple (n = 3) dans des conditions statiques en utilisant des plaques Corning à 96 puits à fond noir et à fond transparent (Corning Glass 3881, USA).Les différences de fluorescence ont été enregistrées à l'aide d'un filtre d'excitation de 440 nm et d'un filtre d'émission de 480 nm (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenburg, Allemagne).Le signal ThT n’était ni saturé ni atténué, car des expériences avec différentes concentrations de ThT ont été réalisées sans modifier l’intensité du signal.Enregistrez l’absorbance à 360 nm pour la mesure du voile.Pour les expériences d'ensemencement, des gels à 100 mg/mL ont été formés à 37°C, remis en suspension et utilisés pour l'ensemencement à des rapports molaires de 5 %, 10 % et 20 %.Les données ont été analysées à l’aide de Prism 9.
Décongeler les stocks de His-NT2RepCT et NT >100 mg/mL sur la glace et filtrer à travers un filtre de 0,22 µm.Les concentrations ont été calculées en mesurant l'absorbance à 280 nm à l'aide de Nanodrop.Dans les puits d'une plaque noire non liante de 96 puits (Corning) avec un fond transparent, les échantillons ont été dilués à 20 mg/ml dans du Tris-HCl 20 mM pH 8 et mélangés avec 5 µM de ThT (concentration finale), concentration totale de l'échantillon. Volume de 50 µl.Les échantillons ont été imagés toutes les 10 minutes à 37 ° C sur un microscope CellObserver (Zeiss) avec canal de lumière transmise et ensembles de filtres d'excitation et d'émission FITC pour l'imagerie ThT.Un objectif 20x/0,4 est utilisé pour l’imagerie.Zen Blue (Zeiss) et ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ont été utilisés pour l'analyse d'images.Des gels ont également été préparés à partir de solutions NT et His-NT2RepCT à une concentration de 50 mg/mL contenant 20 mM de Tris pH 8 et 5 µM de ThT et incubés à 37°C pendant 90 min.Les morceaux de gel ont été transférés dans un nouveau puits contenant 20 mM de Tris, pH 8 et 5 µM de ThT dans une plaque à fond transparent noir à 96 puits non liant.Acquérir des images de fluorescence verte et de champ lumineux à un grossissement de 20x/0,4.ImageJ a été utilisé pour l'analyse d'images.
Les spectres RMN de la solution ont été obtenus à 310 K sur un spectromètre Bruker Avance Neo à 600 MHz équipé d'une crysonde à champ à gradient pulsé à résonance quadripolaire QCI (HFCN).Échantillons RMN contenant 10 mg/mL de protéine homogène marquée au 13C, 15N, dissoute dans 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (p/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Les déplacements chimiques de NT2RepCT à pH 6,7 ont été utilisés pour attribuer le pic 23 dans le spectre 2D du 15N-HSQC.
Les spectres RMN du solide tournant à angle magique (MAS) d'hydrogels marqués au 13C et au 15N ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance III HD à 800 MHz équipé d'une sonde sans électrons 13C/15N{1H} de 3,2 mm.La température de l'échantillon a été contrôlée à l'aide d'un flux de gaz à température variable à 277 K. Les spectres de résonance rotationnelle dipolaire bidimensionnelle (DARR)76 et de reconnexion radiofréquence (RFDR)77 ont été acquis à des fréquences MAS de 12,5 kHz et 20 kHz, respectivement.La polarisation croisée (CP) de 1H à 13C a été réalisée en utilisant une rampe linéaire de 60,0 à 48,0 kHz à 1H, 61,3/71,6 kHz à 13C (à 12,5/20 kHz MAS) et un temps de contact de 0,5 à 1 ms.Le découplage Spinal6478 à 73,5 kHz a été utilisé lors de la collecte de données.Le temps d'acquisition était de 10 millisecondes et le délai de cycle de 2,5 secondes.Les corrélations Cα/Cβ à liaison unique observées dans les spectres RFDR ont été attribuées sur la base des déplacements chimiques caractéristiques de type résidu et des corrélations à liaisons multiples dans les spectres DARR.
La base de données Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) a été utilisée pour évaluer les tendances au flottement et l'énergie de Rosetta pour NT, NTFlSp et NTMiSp.La base de données Zipper calcule Rosetta Energy80, qui combine plusieurs fonctions d'énergie libre pour modéliser et analyser la structure des protéines.Un niveau d’énergie de -23 kcal/mol ou moins indique une forte tendance à la fibrillation.Une énergie plus faible signifie une plus grande stabilité des deux brins β dans la conformation de la fermeture à glissière.De plus, l'algorithme Waltz a été utilisé pour prédire les régions amyloïdogènes dans NT, NTFlSp et NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
La solution de protéine NT a été mélangée avec un tampon d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) à pH 5,5 et 6,0 pour abaisser le pH à pH 6 et 7, respectivement.La concentration finale en protéines était de 100 mg/ml.
Les mesures ont été effectuées sur un spectromètre CD J-1500 (JASCO, USA) en utilisant une cuvette de 300 µL avec un trajet optique de 0,1 cm.Les protéines ont été diluées à 10 µM (n = 1) dans un tampon phosphate 20 mM (pH 8).Pour analyser la stabilité des protéines en présence de sel, les protéines ont été analysées à la même concentration (n = 1) dans un tampon phosphate 20 mM (pH 8) contenant respectivement 154 mM de NaF ou de NaCl.Des analyses de température ont été enregistrées à 222 nm de 25°C à 95°C avec une vitesse de chauffage de 1°C/min.La proportion de protéines repliées nativement a été calculée à l'aide de la formule (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).De plus, cinq spectres ont été enregistrés pour chaque échantillon de 260 nm à 190 nm à 25°C et après chauffage à 95°C.Cinq spectres ont été moyennés, lissés et convertis en ellipticité molaire.Les données ont été analysées à l’aide de Prism 9.
L'intensité de fluorescence de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) a été mesurée en triple (n = 3) dans des plaques Corning à 96 puits avec un fond transparent noir (Corning Glass 3881, USA) dans des conditions statiques.Mesurez les échantillons avec un lecteur de plaques à fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 395 nm et enregistrez l’émission à 509 nm avant la gélification et 2 heures plus tard à 37°C.Les données ont été analysées avec Prism 9.
Un kit de test d'activité de purine nucléoside phosphorylase (méthode fluorométrique, Sigma Aldrich) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.Pour mesurer l'activité dans les gels et les solutions contenant His-NT-PNP, mélangez 10 ng de His-NT-PNP avec 100 mg/mL de NT jusqu'à un volume total de 2 µL car le gel a donné un signal supérieur à l'intervalle de détection de l'ensemble.Des contrôles pour les gels et les solutions sans His-NT-PNP ont été inclus.Les mesures ont été effectuées deux fois (n = 2).Une fois l'activité mesurée, le mélange réactionnel a été retiré et le gel photographié pour garantir que le gel reste intact pendant la mesure.Les données ont été analysées à l’aide de Prism 9.
Pour plus d’informations sur la conception de l’étude, consultez le résumé de l’étude Nature lié à cet article.
Les figures 1 et 2 présentent les données initiales.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f et 6, figures supplémentaires.3, fig. supplémentaire.5a, d, fig. supplémentaire.6 et fig. supplémentaire.8. Données Les données de cette étude sont hébergées dans la base de données Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Les données RMN obtenues dans cette étude ont été publiées dans le référentiel BMRBig sous l'ID d'entrée bmrbig36.Les structures de GFP et PNP ont été tirées de PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. et Johansson, J. Filage de soie d'araignée artificielle.Produit chimique national.la biologie.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et coll.Le génome de Nephila clavipes met en évidence la diversité des gènes de la soie d'araignée et leur expression complexe.Genette Nationale.49, 895-903 (2017).