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SPACA6 est une protéine de surface exprimée par les spermatozoïdes qui est essentielle à la fusion des gamètes lors de la reproduction sexuée des mammifères.Malgré ce rôle fondamental, la fonction spécifique de SPACA6 est mal comprise.Nous élucidons la structure cristalline du domaine extracellulaire de SPACA6 à une résolution de 2,2 Å, révélant une protéine à deux domaines composée d'un faisceau à quatre brins et de sandwichs β de type Ig reliés par des lieurs quasi flexibles.Cette structure ressemble à IZUMO1, une autre protéine associée à la fusion de gamètes, faisant de SPACA6 et IZUMO1 des membres fondateurs de la superfamille des protéines associées à la fécondation appelée ici superfamille IST.La superfamille IST est structurellement définie par son faisceau torsadé de quatre hélices et une paire de motifs CXXC liés par un disulfure.Une recherche AlphaFold basée sur la structure du protéome humain a identifié des membres protéiques supplémentaires de cette superfamille ;notamment, bon nombre de ces protéines sont impliquées dans la fusion des gamètes.La structure SPACA6 et ses relations avec les autres membres de la superfamille IST constituent le chaînon manquant dans notre connaissance de la fusion des gamètes de mammifères.
Chaque vie humaine commence avec deux gamètes haploïdes distincts : le sperme du père et l'ovule de la mère.Ce spermatozoïde est le vainqueur d'un processus de sélection intense au cours duquel des millions de spermatozoïdes traversent le tractus génital féminin, surmontent divers obstacles1 et subissent une capacitation, qui améliore leur motilité et le processus des composants de surface2,3,4.Même si le sperme et l’ovocyte se retrouvent, le processus n’est pas encore terminé.L'ovocyte est entouré d'une couche de cellules cumulus et d'une barrière glycoprotéique appelée zone pellucide, à travers laquelle les spermatozoïdes doivent passer pour pénétrer dans l'ovocyte.Les spermatozoïdes utilisent une combinaison de molécules d’adhésion de surface et d’enzymes associées et sécrétées par la membrane pour surmonter ces barrières finales5.Ces molécules et enzymes sont principalement stockées dans la membrane interne et la matrice acrosomale et sont détectées lors de la lyse de la membrane externe du sperme lors de la réaction acrosomale6.La dernière étape de ce voyage intense est la fusion spermatozoïde-ovule, au cours de laquelle les deux cellules fusionnent leurs membranes pour devenir un seul organisme diploïde7.Bien que ce processus soit révolutionnaire dans le domaine de la reproduction humaine, les interactions moléculaires nécessaires sont mal comprises.
Outre la fécondation des gamètes, la chimie de la fusion de deux bicouches lipidiques a été largement étudiée.En général, la fusion membranaire est un processus énergétiquement défavorable qui nécessite qu'un catalyseur protéique subisse un changement de conformation structurelle qui rapproche deux membranes, rompant leur continuité et provoquant une fusion8,9.Ces catalyseurs protéiques sont connus sous le nom de fusogènes et ont été trouvés dans d’innombrables systèmes de fusion.Ils sont nécessaires à l'entrée du virus dans les cellules hôtes (par exemple, gp160 dans le VIH-1, pic dans les coronavirus, hémagglutinine dans les virus de la grippe)10,11,12 placentaire (syncytine)13,14,15 et fusions formant des gamètes chez les eucaryotes inférieurs ( HAP2/GCS1 chez les plantes, les protistes et les arthropodes) 16,17,18,19.Les fusogènes pour les gamètes humains n'ont pas encore été découverts, bien que plusieurs protéines se soient révélées essentielles à la fixation et à la fusion des gamètes.Le CD9 exprimé dans les ovocytes, une protéine transmembranaire nécessaire à la fusion des gamètes de souris et humains, a été le premier à être découvert 21,22,23.Bien que sa fonction précise reste floue, un rôle dans l'adhésion, la structure des foyers d'adhésion sur les microvillosités de l'œuf et/ou la localisation correcte des protéines de surface de l'ovocyte semble probable 24,25,26.Les deux protéines les plus typiques et essentielles à la fusion des gamètes sont la protéine spermatique IZUMO127 et la protéine ovocytaire JUNO28, et leur association mutuelle constitue une étape importante dans la reconnaissance et l'adhésion des gamètes avant la fusion.Les souris knock-out Izumo1 mâles et les souris knock-out Juno femelles sont complètement stériles. Dans ces modèles, les spermatozoïdes pénètrent dans l'espace périvitellin mais les gamètes ne fusionnent pas.De même, la confluence était réduite lorsque les gamètes étaient traités avec des anticorps anti-IZUMO1 ou JUNO27,29 dans des expériences de fécondation in vitro humaine.
Récemment, un groupe nouvellement découvert de protéines exprimées par les spermatozoïdes phénotypiquement similaires à IZUMO1 et JUNO20,30,31,32,33,34,35 a été découvert.La protéine 6 associée à la membrane acrosomale des spermatozoïdes (SPACA6) a été identifiée comme essentielle à la fécondation dans une étude de mutagenèse murine à grande échelle.L'insertion du transgène dans le gène Spaca6 produit des spermatozoïdes non fusibles, bien que ces spermatozoïdes infiltrent l'espace périvitellin 36 .Des études knock-out ultérieures chez la souris ont confirmé que Spaca6 est nécessaire à la fusion des gamètes 30,32.SPACA6 est exprimé presque exclusivement dans les testicules et présente un schéma de localisation similaire à celui d'IZUMO1, à savoir dans l'intima des spermatozoïdes avant la réaction acrosomale, puis migre vers la région équatoriale après la réaction acrosomale 30,32.Les homologues de Spaca6 existent chez une variété de mammifères et d'autres eucaryotes 30 et son importance pour la fusion des gamètes humains a été démontrée par l'inhibition de la fécondation humaine in vitro par la résistance à SPACA6 30 .Contrairement à IZUMO1 et JUNO, les détails de la structure, des interactions et de la fonction de SPACA6 restent flous.
Pour mieux comprendre le processus fondamental sous-jacent à la fusion des spermatozoïdes et des ovules humains, ce qui nous permettra d'éclairer les développements futurs en matière de planification familiale et de traitement de la fertilité, nous avons mené des études structurelles et biochimiques SPACA6.La structure cristalline du domaine extracellulaire de SPACA6 montre un faisceau à quatre hélices (4HB) et un domaine de type immunoglobuline (de type Ig) reliés par des régions quasi flexibles.Comme prévu dans des études précédentes7,32,37, la structure du domaine de SPACA6 est similaire à celle de l'IZUMO1 humain, et les deux protéines partagent un motif inhabituel : 4HB avec une surface hélicoïdale triangulaire et une paire de motifs CXXC liés par un disulfure.Nous proposons que IZUMO1 et SPACA6 définissent désormais une superfamille de protéines plus grande, structurellement apparentée, associée à la fusion des gamètes.En utilisant des caractéristiques uniques à la superfamille, nous avons mené une recherche exhaustive du protéome humain structurel AlphaFold, identifiant des membres supplémentaires de cette superfamille, y compris plusieurs membres impliqués dans la fusion et/ou la fécondation des gamètes.Il semble maintenant qu'il existe un repli structurel commun et une superfamille de protéines associées à la fusion des gamètes, et notre structure fournit une carte moléculaire de cet aspect important du mécanisme de fusion des gamètes humains.
SPACA6 est une protéine transmembranaire à passage unique avec un glycane lié à N et six liaisons disulfure putatives (figures S1a et S2).Nous avons exprimé le domaine extracellulaire de SPACA6 humain (résidus 27 à 246) dans des cellules de drosophile S2 et purifié la protéine par chromatographie d'affinité pour le nickel, d'échange de cations et d'exclusion de taille (Fig. S1b).L'ectodomaine SPACA6 purifié est très stable et homogène.L'analyse utilisant la chromatographie d'exclusion de taille combinée à la diffusion polygonale de la lumière (SEC-MALS) a révélé un pic avec un poids moléculaire calculé de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Ceci est cohérent avec la taille de l'ectodomaine monomère SPACA6, indiquant qu'une oligomérisation ne s'est pas produite pendant la purification.De plus, la spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) a révélé une structure mixte α/β avec un point de fusion de 51,3 °C (Fig. S1d, e).La déconvolution des spectres CD a révélé 38,6 % d'éléments en hélice α et 15,8 % d'éléments à brin β (Figure S1d).
L'ectodomaine SPACA6 a été cristallisé à l'aide d'un ensemencement matriciel aléatoire38, ce qui a donné un ensemble de données avec une résolution de 2,2 Å (Tableau 1 et Figure S3).En utilisant une combinaison de substitution moléculaire basée sur des fragments et de données de mise en phase SAD avec exposition au bromure pour la détermination de la structure (Tableau 1 et Figure S4), le modèle final raffiné est constitué des résidus 27 à 246.Au moment où la structure a été déterminée, aucune structure expérimentale ou AlphaFold n’était disponible.L'ectodomaine SPACA6 mesure 20 Å × 20 Å × 85 Å, est constitué de sept hélices et de neuf brins β et possède un pli tertiaire allongé stabilisé par six liaisons disulfure (Fig. 1a, b).La faible densité électronique à l'extrémité de la chaîne latérale Asn243 indique que ce résidu est une glycosylation liée à l'azote.La structure se compose de deux domaines : un faisceau de quatre hélices N-terminal (4HB) et un domaine de type Ig C-terminal avec une région charnière intermédiaire entre eux (Fig. 1c).
une Structure du domaine extracellulaire de SPACA6.Diagramme en bande du domaine extracellulaire de SPACA6, la couleur de la chaîne de l'extrémité N à l'extrémité C du bleu foncé au rouge foncé.Les cystéines impliquées dans les liaisons disulfure sont mises en évidence en magenta.b Topologie du domaine extracellulaire de SPACA6.Utilisez la même palette de couleurs que dans la figure 1a.c Domaine extracellulaire SPACA6.Les graphiques en bandes de domaines 4HB, charnière et de type Ig sont respectivement colorés en orange, vert et bleu.Les calques ne sont pas dessinés à l'échelle.
Le domaine 4HB de SPACA6 comprend quatre hélices principales (hélices 1 à 4), disposées sous la forme d'une hélice hélicoïdale (Fig. 2a), alternant entre interactions antiparallèles et parallèles (Fig. 2b).Une petite hélice supplémentaire à un seul tour (hélice 1') est posée perpendiculairement au faisceau, formant un triangle avec les hélices 1 et 2. Ce triangle est légèrement déformé dans l'emballage hélicoïdal torsadé de l'emballage relativement dense des hélices 3 et 4 ( Fig.2a).
Tableau des borniers N 4HB.b Vue de dessus d'un faisceau de quatre hélices, chaque hélice étant surlignée en bleu foncé à l'extrémité N-terminale et en rouge foncé à l'extrémité C-terminale.c Diagramme de roue en spirale descendant pour 4HB, chaque résidu étant représenté par un cercle étiqueté avec un code d'acide aminé à une seule lettre ;seuls les quatre acides aminés en haut de la roue sont numérotés.Les résidus non polaires sont colorés en jaune, les résidus polaires non chargés sont colorés en vert, les résidus chargés positivement sont colorés en bleu et les résidus chargés négativement sont colorés en rouge.d Faces triangulaires du domaine 4HB, avec 4HB en orange et charnières en vert.Les deux encarts montrent des liaisons disulfure en forme de bâtonnet.
Le 4HB est concentré sur un noyau hydrophobe interne composé principalement de résidus aliphatiques et aromatiques (Fig. 2c).Le noyau contient une liaison disulfure entre Cys41 et Cys55 qui relie les hélices 1 et 2 ensemble dans un triangle supérieur surélevé (Fig. 2d).Deux liaisons disulfure supplémentaires ont été formées entre le motif CXXC dans l'hélice 1 'et un autre motif CXXC trouvé à l'extrémité de l'épingle à cheveux β dans la région charnière (Fig. 2d).Un résidu d'arginine conservateur avec une fonction inconnue (Arg37) est situé à l'intérieur d'un triangle creux formé par les hélices 1', 1 et 2. Les atomes de carbone aliphatiques Cβ, Cγ et Cδ Arg37 interagissent avec le noyau hydrophobe et ses groupes guanidine se déplacent de manière cyclique. entre les hélices 1 'et 1 via des interactions entre le squelette Thr32 et la chaîne latérale (Fig. S5a, b).Tyr34 s'étend dans la cavité, laissant deux petites cavités à travers lesquelles Arg37 peut interagir avec le solvant.
Les domaines β-sandwich de type Ig sont une grande superfamille de protéines qui partagent la caractéristique commune de deux ou plusieurs feuillets β amphipathiques multibrins interagissant via un noyau hydrophobe 39. Le domaine de type Ig C-terminal de SPACA6 a le même modèle. et se compose de deux couches (Fig. S6a).La feuille 1 est une feuille β de quatre brins (brins D, F, H et I) où les brins F, H et I forment un arrangement antiparallèle et les brins I et D entreprennent une interaction parallèle.Le tableau 2 est une petite feuille bêta double brin antiparallèle (brins E et G).Une liaison disulfure interne a été observée entre l'extrémité C de la chaîne E et le centre de la chaîne H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Cette liaison disulfure est analogue à la liaison disulfure dans le domaine sandwich β de l'immunoglobuline 40,41.
La feuille β à quatre brins se tord sur toute sa longueur, formant des bords asymétriques qui diffèrent par leur forme et leur électrostatique.Le bord le plus fin est une surface environnementale hydrophobe plate qui se distingue des autres surfaces inégales et électrostatiquement diverses dans SPACA6 (Fig. S6b, c).Un halo de groupes carbonyle/amino du squelette exposé et de chaînes latérales polaires entoure la surface hydrophobe (Fig. S6c).La marge la plus large est recouverte par un segment hélicoïdal coiffé qui bloque la partie N-terminale du noyau hydrophobe et forme trois liaisons hydrogène avec le groupe polaire ouvert du squelette de la chaîne F (Fig. S6d).La partie C-terminale de ce bord forme une grande poche avec un noyau hydrophobe partiellement exposé.La poche est entourée de charges positives dues à trois ensembles de résidus doubles arginine (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 et Arg212-Arg214) et à une histidine centrale (His220) (Figure S6e).
La région charnière est un court segment entre le domaine hélicoïdal et le domaine de type Ig, constitué d'une couche β antiparallèle à trois brins (brins A, B et C), d'une petite hélice 310 et de plusieurs longs segments hélicoïdaux aléatoires.(Fig. S7).Un réseau de contacts covalents et électrostatiques dans la région charnière semble stabiliser l'orientation entre 4HB et le domaine de type Ig.Le réseau peut être divisé en trois parties.La première partie comprend deux motifs CXXC (27CXXC30 et 139CXXC142) qui forment une paire de liaisons disulfure entre l'épingle à cheveux β de la charnière et l'hélice 1 'de 4HB.La deuxième partie comprend les interactions électrostatiques entre le domaine de type Ig et la charnière.Glu132 dans la charnière forme un pont salin avec Arg233 dans le domaine de type Ig et Arg135 dans la charnière.La troisième partie comprend une liaison covalente entre le domaine de type Ig et la région charnière.Deux liaisons disulfure (Cys124-Cys147 et Cys128-Cys153) relient la boucle charnière à un lieur stabilisé par des interactions électrostatiques entre Gln131 et le groupe fonctionnel du squelette, permettant l'accès au premier domaine de type Ig.chaîne.
La structure de l'ectodomaine SPACA6 et les structures individuelles des domaines 4HB et Ig-like ont été utilisées pour rechercher des enregistrements structurellement similaires dans des bases de données de protéines 42.Nous avons identifié des correspondances avec des scores Dali Z élevés, de petits écarts types et des scores LALI élevés (ce dernier étant le nombre de résidus structurellement équivalents).Alors que les 10 premiers résultats de la recherche complète d'ectodomaines (tableau S1) présentaient un score Z acceptable supérieur à 842, une recherche du domaine 4HB ou de type Ig seul a montré que la plupart de ces résultats correspondaient uniquement à des sandwichs β.un repli omniprésent dans de nombreuses protéines.Les trois recherches à Dali n’ont donné qu’un seul résultat : IZUMO1.
Il a longtemps été suggéré que SPACA6 et IZUMO1 partageaient des similitudes structurelles7,32,37.Bien que les ectodomaines de ces deux protéines associées à la fusion de gamètes ne partagent qu'une identité de séquence de 21 % (Figure S8a), des preuves complexes, notamment un modèle de liaison disulfure conservé et un domaine de type Ig C-terminal prédit dans SPACA6, ont permis les premières tentatives de construction d'un modèle d'homologie de A une souris SPACA6 utilisant IZUMO1 comme modèle 37.Notre structure confirme ces prédictions et montre le véritable degré de similarité.En fait, les structures SPACA6 et IZUMO137, 43, 44 partagent la même architecture à deux domaines (Fig. S8b) avec des domaines sandwich β similaires de type 4HB et Ig reliés par une région charnière (Fig. S8c).
IZUMO1 et SPACA6 4HB présentent des différences communes par rapport aux faisceaux spiralés conventionnels.Les 4HB typiques, comme ceux trouvés dans les complexes protéiques SNARE impliqués dans la fusion endosomale 45,46, ont des hélices régulièrement espacées maintenant une courbure constante autour d'un axe central 47. En revanche, les domaines hélicoïdaux dans IZUMO1 et SPACA6 étaient déformés, avec une courbure et une courbure variables. emballage inégal (figure S8d).La torsion, probablement provoquée par le triangle formé des hélices 1', 1 et 2, est retenue dans IZUMO1 et SPACA6 et stabilisée par le même motif CXXC sur l'hélice 1'.Cependant, la liaison disulfure supplémentaire trouvée dans SPACA6 (Cys41 et Cys55 reliant de manière covalente les hélices 1 et 2 ci-dessus) crée un sommet plus net au sommet du triangle, rendant SPACA6 plus tordu que IZUMO1, avec des triangles de cavité plus prononcés.De plus, IZUMO1 est dépourvu d'Arg37 observé au centre de cette cavité dans SPACA6.En revanche, IZUMO1 possède un noyau hydrophobe plus typique de résidus aliphatiques et aromatiques.
IZUMO1 possède un domaine de type Ig constitué d'une feuille β double brin et cinq brins .Le brin supplémentaire dans IZUMO1 remplace la bobine dans SPACA6, qui interagit avec le brin F pour limiter les liaisons hydrogène du squelette dans le brin.Un point de comparaison intéressant est la charge de surface prévue des domaines de type Ig des deux protéines.La surface IZUMO1 est plus chargée négativement que la surface SPACA6.Une charge supplémentaire est située près de l’extrémité C-terminale face à la membrane du spermatozoïde.Dans SPACA6, les mêmes régions étaient plus neutres ou chargées positivement (Fig. S8e).Par exemple, la surface hydrophobe (bords plus fins) et les creux chargés positivement (bords plus larges) dans SPACA6 sont chargés négativement dans IZUMO1.
Bien que la relation et les éléments de structure secondaires entre IZUMO1 et SPACA6 soient bien préservés, l'alignement structurel des domaines de type Ig a montré que les deux domaines diffèrent par leur orientation générale l'un par rapport à l'autre (Fig. S9).Le faisceau spiralé d’IZUMO1 est courbé autour du sandwich β, créant la forme de « boomerang » décrite précédemment à environ 50° de l’axe central.En revanche, le faisceau hélicoïdal de SPACA6 était incliné d’environ 10° dans la direction opposée.Les différences dans ces orientations sont probablement dues à des différences dans la région charnière.Au niveau de la séquence primaire, IZUMO1 et SPACA6 partagent peu de similarité de séquence au niveau de la charnière, à l'exception des résidus cystéine, glycine et acide aspartique.En conséquence, les liaisons hydrogène et les réseaux électrostatiques sont complètement différents.Les éléments de structure secondaire de la feuille β sont partagés par IZUMO1 et SPACA6, bien que les chaînes de IZUMO1 soient beaucoup plus longues et que l'hélice 310 (hélice 5) soit unique à SPACA6.Ces différences se traduisent par des orientations de domaine différentes pour deux protéines par ailleurs similaires.
Notre recherche sur le serveur Dali a révélé que SPACA6 et IZUMO1 sont les deux seules structures déterminées expérimentalement et stockées dans la base de données protéique qui possèdent ce repli 4HB particulier (Tableau S1).Plus récemment, DeepMind (Alphabet/Google) a développé AlphaFold, un système basé sur un réseau neuronal capable de prédire avec précision les structures 3D des protéines à partir de séquences primaires48.Peu de temps après avoir résolu la structure SPACA6, la base de données AlphaFold a été publiée, fournissant des modèles de structure prédictifs couvrant 98,5 % de toutes les protéines du protéome humain48,49.En utilisant notre structure SPACA6 résolue comme modèle de recherche, une recherche d'homologie structurelle du modèle dans le protéome humain AlphaFold a identifié des candidats présentant des similitudes structurelles possibles avec SPACA6 et IZUMO1.Compte tenu de l'incroyable précision d'AlphaFold dans la prédiction de SPACA6 (Fig. S10a) - en particulier de l'ectodomaine de 1, 1 Å rms par rapport à notre structure résolue (Fig. S10b) - nous pouvons être sûrs que les correspondances SPACA6 identifiées sont susceptibles d'être exactes.
Auparavant, PSI-BLAST recherchait le cluster IZUMO1 avec trois autres protéines associées aux spermatozoïdes : IZUMO2, IZUMO3 et IZUMO450.AlphaFold a prédit que ces protéines de la famille IZUMO se replient dans le domaine 4HB avec le même modèle de liaisons disulfure que IZUMO1 (Figures 3a et S11), bien qu'il leur manque un domaine de type Ig.On suppose que IZUMO2 et IZUMO3 sont des protéines membranaires unilatérales similaires à IZUMO1, tandis qu'IZUMO4 semble être sécrété.Les fonctions des protéines IZUMO 2, 3 et 4 dans la fusion des gamètes n'ont pas été déterminées.IZUMO3 est connu pour jouer un rôle dans la biogenèse des acrosomes au cours du développement des spermatozoïdes51, et la protéine IZUMO forme un complexe50.La conservation des protéines IZUMO chez les mammifères, les reptiles et les amphibiens suggère que leur fonction potentielle est cohérente avec celle d'autres protéines connues associées à la fusion des gamètes, telles que DCST1/2, SOF1 et FIMP.
Diagramme de l'architecture de domaine de la superfamille IST, avec les domaines 4HB, charnière et de type Ig surlignés en orange, vert et bleu, respectivement.IZUMO4 possède une région C-terminale unique qui semble noire.Les liaisons disulfure confirmées et putatives sont représentées respectivement par des lignes pleines et pointillées.b IZUMO1 (PDB : 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB : AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB : AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB : AF-Q1ZYL8-F1) et TMEM95 (AlphaFold DB : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) sont affichés dans la même gamme de couleurs que le panneau A. Les liaisons disulfure sont représentées en magenta.Les hélices transmembranaires TMEM95, IZUMO2 et IZUMO3 ne sont pas représentées.
Contrairement à la protéine IZUMO, on pense que d'autres protéines SPACA (c'est-à-dire SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 et SPACA9) sont structurellement différentes de SPACA6 (Fig. S12).Seul SPACA9 possède 4HB, mais il ne devrait pas avoir la même orientation parallèle-anti-parallèle ou la même liaison disulfure que SPACA6.Seule SPACA1 possède un domaine de type Ig similaire.AlphaFold prédit que SPACA3, SPACA4 et SPACA5 ont une structure complètement différente de SPACA6.Il est intéressant de noter que SPACA4 est également connu pour jouer un rôle dans la fécondation, mais dans une plus grande mesure que SPACA6, facilitant plutôt l’interaction entre les spermatozoïdes et la zone pellucide de l’ovocyte52.
Notre recherche AlphaFold a trouvé une autre correspondance pour IZUMO1 et SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, une protéine transmembranaire spécifique au sperme, rend les souris mâles stériles lors de l'ablation 32,33.Les spermatozoïdes dépourvus de TMEM95 avaient une morphologie, une motilité et une capacité normales à pénétrer dans la zone pellucide et à se lier à la membrane de l'œuf, mais ne pouvaient pas fusionner avec la membrane de l'ovocyte.Des études antérieures ont montré que TMEM95 partage des similitudes structurelles avec IZUMO133.En effet, le modèle AlphaFold a confirmé que TMEM95 est un 4HB avec la même paire de motifs CXXC que IZUMO1 et SPACA6 et la même liaison disulfure supplémentaire entre les hélices 1 et 2 trouvée dans SPACA6 (Fig. 3a et S11).Bien que TMEM95 ne possède pas de domaine de type Ig, il possède une région avec un motif de liaison disulfure similaire aux régions charnières SPACA6 et IZUMO1 (Fig. 3b).Au moment de la publication de ce manuscrit, le serveur de préimpression a signalé la structure de TMEM95, confirmant le résultat AlphaFold53.TMEM95 est très similaire à SPACA6 et IZUMO1 et est déjà conservé au cours de l'évolution chez les amphibiens (Fig. 4 et S13).
La recherche PSI-BLAST a utilisé les bases de données NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP et SOF1 pour déterminer la position de ces séquences dans l'arbre de vie.Les distances entre les points de branchement ne sont pas affichées à l'échelle.
La similitude structurelle globale frappante entre SPACA6 et IZUMO1 suggère qu'ils sont des membres fondateurs d'une superfamille structurelle conservée qui comprend les protéines TMEM95 et IZUMO 2, 3 et 4.membres connus : IZUMO1, SPACA6 et TMEM95.Étant donné que seuls quelques membres possèdent des domaines de type Ig, la marque distinctive de la superfamille IST est le domaine 4HB, qui présente des caractéristiques uniques communes à toutes ces protéines : 1) 4HB enroulé avec des hélices disposées selon une alternance anti-parallèle/parallèle (Fig. . 5a), 2) le faisceau a une face triangulaire constituée de deux hélices à l'intérieur du faisceau et d'une troisième hélice verticale (zone clé de la Fig. (Fig. 5c). Le motif CXXC, trouvé dans les protéines de type thiorédoxine, est connu pour fonctionner comme capteur redox 54,55,56, tandis que le motif chez les membres de la famille IST peut être associé à des protéines disulfure isomérases telles que ERp57 dans la fusion des gamètes.
Les membres de la superfamille IST sont définis par trois caractéristiques du domaine 4HB : quatre hélices alternant entre une orientation parallèle et antiparallèle, des faces de faisceaux hélicoïdaux ba-triangulaires et un double motif ca CXXC formé entre de petites molécules.) Hélices N-terminales (orange) et région charnière en épingle à cheveux β (vert).
Compte tenu de la similitude entre SPACA6 et IZUMO1, la capacité du premier à se lier à IZUMO1 ou JUNO a été testée.L'interférométrie de biocouche (BLI) est une méthode de liaison basée sur la cinétique qui a déjà été utilisée pour quantifier l'interaction entre IZUMO1 et JUNO.Après l'incubation du capteur marqué à la biotine avec IZUMO1 comme appât avec une concentration élevée d'analyte JUNO, un signal fort a été détecté (Fig. S14a), indiquant un changement induit par la liaison dans l'épaisseur du biomatériau attaché à la pointe du capteur.Signaux similaires (c'est-à-dire JUNO couplé au capteur comme appât contre l'analyte IZUMO1) (Fig. S14b).Aucun signal n'a été détecté lorsque SPACA6 a été utilisé comme analyte contre IZUMO1 lié au capteur ou JUNO lié au capteur (Figure S14a, b).L'absence de ce signal indique que le domaine extracellulaire de SPACA6 n'interagit pas avec le domaine extracellulaire d'IZUMO1 ou JUNO.
Étant donné que le test BLI est basé sur la biotinylation des résidus de lysine libres sur la protéine d'appât, cette modification peut empêcher la liaison si des résidus de lysine sont impliqués dans l'interaction.De plus, l’orientation de la liaison par rapport au capteur peut créer des obstacles stériques, c’est pourquoi des tests pull-down conventionnels ont également été effectués sur les ectodomaines recombinants SPACA6, IZUMO1 et JUNO.Malgré cela, SPACA6 n'a pas précipité avec IZUMO1 marqué par His ou JUNO marqué par His (Fig. S14c, d), indiquant aucune interaction cohérente avec celle observée dans les expériences BLI.En tant que contrôle positif, nous avons confirmé l'interaction de JUNO avec His IZUMO1 marqué (figures S14e et S15).
Malgré la similitude structurelle entre SPACA6 et IZUMO1, l'incapacité de SPACA6 à se lier à JUNO n'est pas surprenante.La surface de l'IZUMO1 humain contient plus de 20 résidus qui interagissent avec JUNO, y compris des résidus de chacune des trois régions (bien que la plupart d'entre eux soient situés dans la région charnière) (Fig. S14f).Parmi ces résidus, un seul est conservé dans SPACA6 (Glu70).Alors que de nombreuses substitutions de résidus ont conservé leurs propriétés biochimiques d'origine, le résidu Arg160 essentiel dans IZUMO1 a été remplacé par l'Asp148 chargé négativement dans SPACA6 ;des études antérieures ont montré que la mutation Arg160Glu dans IZUMO1 supprime presque complètement la liaison à JUNO43.De plus, la différence d'orientation du domaine entre IZUMO1 et SPACA6 a considérablement augmenté la surface du site de liaison JUNO de la région équivalente sur SPACA6 (Fig. S14g).
Malgré le besoin connu de SPACA6 pour la fusion des gamètes et sa similitude avec IZUMO1, SPACA6 ne semble pas avoir de fonction de liaison JUNO équivalente.Par conséquent, nous avons cherché à combiner nos données structurelles avec les preuves d’importance fournies par la biologie évolutive.L'alignement des séquences des homologues de SPACA6 montre la conservation de la structure commune au-delà des mammifères.Par exemple, les résidus de cystéine sont présents même chez des amphibiens éloignés (Fig. 6a).À l'aide du serveur ConSurf, plusieurs données de rétention d'alignement de séquences de 66 séquences ont été mappées sur la surface SPACA6.Ce type d'analyse peut montrer quels résidus ont été conservés au cours de l'évolution des protéines et indiquer quelles régions de surface jouent un rôle dans la fonction.
un Alignement de séquence d'ectodomaines SPACA6 de 12 espèces différentes préparés à l'aide de CLUSTAL OMEGA.Selon l’analyse ConSurf, les positions les plus conservatrices sont marquées en bleu.Les résidus de cystéine sont surlignés en rouge.Les limites du domaine et les éléments de structure secondaires sont affichés en haut de l'alignement, où les flèches indiquent les brins β et les ondes indiquent les hélices.Les identifiants d'accès NCBI contenant les séquences sont : humain (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), singe capucin (Cebus mimic, XP_017359366), cheval (Equus caballus, XP_023506102), épaulard (Orcinus orca3_23 XP_032_0). 34) .), mouton (Ovis aries, XP_014955560), éléphant (Loxodonta africana, XP_010585293), chien (Canis lupus familyis, XP_025277208), souris (Mus musculus, NP_001156381), diable de Tasmanie (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), ornithorynque, 8) , 61_89 et Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).La numérotation est basée sur l'ordre humain.b Représentation en surface de la structure SPACA6 avec 4HB en haut et domaine de type Ig en bas, couleurs basées sur les estimations de conservation du serveur ConSurf.Les parties les mieux conservées sont en bleu, les parties moyennement conservées sont en blanc et les moins conservées sont en jaune.cystéine violette.Trois patchs de surface démontrant un niveau élevé de protection sont représentés dans l'encadré intitulé patchs 1, 2 et 3. Un dessin animé 4HB est présenté dans l'encadré en haut à droite (même palette de couleurs).
La structure SPACA6 possède trois régions de surface hautement conservées (Fig. 6b).Le patch 1 couvre 4HB et la région charnière et contient deux ponts disulfure CXXC conservés, un réseau charnière Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) et trois résidus aromatiques externes conservés (Phe31, Tyr73, Phe137)).un bord plus large du domaine de type Ig (Fig. S6e), qui représente plusieurs résidus chargés positivement à la surface du sperme.Il est intéressant de noter que ce patch contient un épitope d’anticorps dont il a déjà été démontré qu’il interférait avec la fonction SPACA6 30.La région 3 s'étend sur la charnière et sur un côté du domaine de type Ig ;cette région contient des prolines conservées (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) et des résidus polaires/chargés orientés vers l'extérieur.Étonnamment, la plupart des résidus à la surface de 4HB sont très variables (Fig. 6b), bien que le pli soit conservé dans tout l'homologue SPACA6 (comme l'indique le conservatisme du noyau du faisceau hydrophobe) et au-delà de la superfamille IST.
Bien qu'il s'agisse de la plus petite région de SPACA6 avec le moins d'éléments de structure secondaires détectables, de nombreux restes de régions charnières (y compris la région 3) sont hautement conservés parmi les homologues de SPACA6, ce qui peut indiquer que l'orientation du faisceau hélicoïdal et du sandwich β joue un rôle.en tant que conservateur.Cependant, malgré de vastes réseaux de liaisons hydrogène et électrostatiques dans la région charnière de SPACA6 et IZUMO1, des preuves de flexibilité intrinsèque peuvent être observées dans l'alignement des multiples structures autorisées d'IZUMO137,43,44.L'alignement des domaines individuels se chevauchait bien, mais l'orientation des domaines les uns par rapport aux autres variait de 50 ° à 70 ° par rapport à l'axe central (Fig. S16).Pour comprendre la dynamique conformationnelle de SPACA6 en solution, des expériences SAXS ont été réalisées (Fig. S17a, b).La reconstruction ab initio de l'ectodomaine SPACA6 était conforme à une structure cristalline en bâtonnet (Fig. S18), bien que le tracé de Kratky ait montré un certain degré de flexibilité (Fig. S17b).Cette conformation contraste avec IZUMO1, dans laquelle la protéine non liée prend une forme de boomerang à la fois dans le réseau et en solution43.
Pour identifier spécifiquement la région flexible, une spectroscopie de masse par échange hydrogène-deutérium (H-DXMS) a été réalisée sur SPACA6 et comparée aux données précédemment obtenues sur IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 est clairement plus flexible que IZUMO1, comme l'indique un échange de deutérium plus élevé dans toute la structure après 100 000 s d'échange.Dans les deux structures, la partie C-terminale de la région charnière présente un niveau d'échange élevé, ce qui permet probablement une rotation limitée des domaines 4HB et Ig-like les uns par rapport aux autres.Il est intéressant de noter que la partie C-terminale de la charnière SPACA6, constituée du résidu 147CDLPLDCP154, est une région 3 hautement conservée (Fig. 6b), indiquant peut-être que la flexibilité interdomaine est une caractéristique conservée au cours de l'évolution de SPACA6.Selon l'analyse de flexibilité, les données de fusion thermique du CD ont montré que SPACA6 (Tm = 51,2 °C) est moins stable que IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e et S19).
a Images H-DXMS de SPACA6 et b IZUMO1.Le pourcentage d'échange de deutérium a été déterminé aux moments indiqués.Les niveaux d'échange hydrogène-deutérium sont indiqués par une couleur sur une échelle de dégradé allant du bleu (10 %) au rouge (90 %).Les boîtes noires représentent les zones de forts échanges.Les limites du domaine 4HB, charnière et de type Ig observées dans la structure cristalline sont indiquées au-dessus de la séquence primaire.Les niveaux d'échange de deutérium à 10 s, 1 000 s et 100 000 s ont été tracés sur un diagramme en bandes superposé aux surfaces moléculaires transparentes de SPACA6 et IZUMO1.Les parties des structures avec un niveau d'échange de deutérium inférieur à 50 % sont colorées en blanc.Les zones supérieures à 50 % d’échange H-DXMS sont colorées sur une échelle de dégradé.
L’utilisation de stratégies génétiques d’inactivation de gènes CRISPR/Cas9 et de souris a conduit à l’identification de plusieurs facteurs importants pour la liaison et la fusion des spermatozoïdes et des ovules.Outre l'interaction bien caractérisée de la structure IZUMO1-JUNO et CD9, la plupart des protéines associées à la fusion des gamètes restent structurellement et fonctionnellement énigmatiques.La caractérisation biophysique et structurelle de SPACA6 est une autre pièce du puzzle moléculaire d’adhésion/fusion lors de la fécondation.
SPACA6 et d'autres membres de la superfamille IST semblent être hautement conservés chez les mammifères ainsi que chez les oiseaux, les reptiles et les amphibiens ;en fait, on pense que SPACA6 est même nécessaire à la fécondation chez le poisson zèbre 59. Cette distribution est similaire à d'autres protéines associées à la fusion de gamètes connues telles que DCST134, DCST234, FIMP31 et SOF132, ce qui suggère que ces facteurs sont déficients en HAP2 (également connues sous le nom de GCS1) qui sont responsables de l’activité catalytique de nombreux protistes., les plantes et les arthropodes.Protéines de fusion fécondées 60, 61. Malgré la forte similitude structurelle entre SPACA6 et IZUMO1, l'inactivation des gènes codant pour l'une ou l'autre de ces protéines a entraîné l'infertilité chez les souris mâles, indiquant que leurs fonctions dans la fusion des gamètes ne sont pas dupliquées..Plus largement, aucune des protéines spermatiques connues nécessaires à la phase d’adhésion de la fusion n’est redondante.
La question reste ouverte de savoir si SPACA6 (et d'autres membres de la superfamille IST) participent aux jonctions intergamétiques, forment des réseaux intragamétiques pour recruter des protéines importantes aux points de fusion, ou peut-être même agissent comme des fusogènes insaisissables.Des études de co-immunoprécipitation dans des cellules HEK293T ont révélé une interaction entre IZUMO1 complet et SPACA632.Cependant, nos ectodomaines recombinants n'ont pas interagi in vitro, ce qui suggère que les interactions observées dans Noda et al.ont tous deux été supprimés dans la construction (notez la queue cytoplasmique d'IZUMO1, qui s'est avérée inutile pour la fécondation62).Alternativement, IZUMO1 et/ou SPACA6 peuvent nécessiter des environnements de liaison spécifiques que nous ne reproduisons pas in vitro, tels que des conformations physiologiquement spécifiques ou des complexes moléculaires contenant d'autres protéines (connues ou non encore découvertes).Bien que l’on pense que l’ectodomaine IZUMO1 assure la fixation des spermatozoïdes à l’ovule dans l’espace périvitellin, le but de l’ectodomaine SPACA6 n’est pas clair.
La structure de SPACA6 révèle plusieurs surfaces conservées qui peuvent être impliquées dans les interactions protéine-protéine.La partie conservée de la région charnière immédiatement adjacente au motif CXXC (désignée Patch 1 ci-dessus) possède plusieurs résidus aromatiques orientés vers l'extérieur qui sont souvent associés à des interactions hydrophobes et d'empilement π entre biomolécules.Les larges côtés du domaine de type Ig (région 2) forment un sillon chargé positivement avec des résidus Arg et His hautement conservés, et des anticorps dirigés contre cette région ont déjà été utilisés pour bloquer la fusion des gamètes 30 .L'anticorps reconnaît l'épitope linéaire 212RIRPAQLTHRGTFS225, qui possède trois des six résidus arginine et His220 hautement conservé.Il n’est pas clair si le dysfonctionnement est dû au blocage de ces résidus spécifiques ou de la région entière.L'emplacement de cet espace près de l'extrémité C-terminale du sandwich β indique des interactions cis avec les protéines spermatiques voisines, mais pas avec les protéines ovocytaires.De plus, la rétention d'un enchevêtrement riche en proline très flexible (site 3) au sein de la charnière peut être le site d'une interaction protéine-protéine ou, plus probablement, indiquer la rétention de flexibilité entre les deux domaines.Le sexe est important pour le rôle inconnu de SPACA6.fusion de gamètes.
SPACA6 possède les propriétés des protéines d’adhésion intercellulaire, notamment les β-sandwichs de type Ig.De nombreuses protéines adhésives (par exemple, les cadhérines, les intégrines, les adhésines et IZUMO1) possèdent un ou plusieurs domaines sandwich β qui étendent les protéines de la membrane cellulaire à leurs cibles environnementales63,64,65.Le domaine de type Ig de SPACA6 contient également un motif couramment trouvé dans les sandwichs β d'adhésion et de cohésion : des doublets de brins parallèles aux extrémités des sandwichs β, appelés pinces mécaniques66.On pense que ce motif augmente la résistance aux forces de cisaillement, ce qui est précieux pour les protéines impliquées dans les interactions intercellulaires.Cependant, malgré cette similitude avec les adhésines, il n’existe actuellement aucune preuve que SPACA6 interagisse avec les blancs d’œufs.L'ectodomaine SPACA6 est incapable de se lier à JUNO et les cellules HEK293T exprimant SPACA6, comme indiqué ici, interagissent à peine avec les ovocytes dépourvus de zone 32.Si SPACA6 établit des liaisons intergamétiques, ces interactions peuvent nécessiter des modifications post-traductionnelles ou une stabilisation par d'autres protéines spermatiques.À l'appui de cette dernière hypothèse, les spermatozoïdes déficients en IZUMO1 se lient aux ovocytes, démontrant que d'autres molécules qu'IZUMO1 sont impliquées dans l'étape d'adhésion des gamètes 27 .
De nombreuses protéines de fusion virales, cellulaires et développementales ont des propriétés qui prédisent leur fonction de fusogènes.Par exemple, les glycoprotéines de fusion virales (classes I, II et III) possèdent un peptide de fusion hydrophobe ou une boucle à l'extrémité de la protéine qui est insérée dans la membrane hôte.La carte d'hydrophilie d'IZUMO143 et la structure (déterminée et prédite) de la superfamille IST n'ont montré aucun peptide de fusion hydrophobe apparent.Ainsi, si des protéines de la superfamille IST fonctionnent comme des fusogènes, elles le font d'une manière différente des autres exemples connus.
En conclusion, les fonctions des membres de la superfamille IST de protéines associées à la fusion des gamètes restent un mystère alléchant.Notre molécule recombinante SPACA6 caractérisée et sa structure résolue fourniront un aperçu des relations entre ces structures partagées et de leur rôle dans l'attachement et la fusion des gamètes.
La séquence d'ADN correspondant à l'ectodomaine SPACA6 humain prédit (numéro d'accès NCBI NP_001303901.1; résidus 27 à 246) a été optimisée en codons pour l'expression dans des cellules de Drosophila melanogaster S2 et synthétisée sous forme de fragment de gène avec la séquence codant pour Kozak (Eurofins Genomics)., le signal de sécrétion BiP et les extrémités 5 'et 3' correspondantes pour le clonage indépendant de la ligature de ce gène dans un vecteur d'expression pMT basé sur un promoteur de métallothionéine modifié pour la sélection avec de la puromycine (pMT-puro).Le vecteur pMT-puro code pour un site de clivage de la thrombine suivi d'une étiquette C-terminale 10x-His (Figure S2).
Une transfection stable du vecteur SPACA6 pMT-puro dans des cellules de D. melanogaster S2 (Gibco) a été réalisée de la même manière que le protocole utilisé pour IZUMO1 et JUNO43.Les cellules S2 ont été décongelées et cultivées dans du milieu de Schneider (Gibco) additionné d'une concentration finale de 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Gibco) et d'un antibiotique antimycosique 1X (Gibco).Les cellules à passage précoce (3,0 x 106 cellules) ont été étalées dans des puits individuels de plaques à 6 puits (Corning).Après 24 heures d'incubation à 27 ° C, les cellules ont été transfectées avec un mélange de 2 mg du vecteur SPACA6 pMT-puro et du réactif de transfection Effectene (Qiagen) selon le protocole du fabricant.Les cellules transfectées ont été incubées pendant 72 heures puis récoltées avec 6 mg/ml de puromycine.Les cellules ont ensuite été isolées du milieu complet de Schneider et placées dans un milieu Insect-XPRESS (Lonza) sans sérum pour la production de protéines à grande échelle.Un lot de 1 L de culture cellulaire S2 a été cultivé jusqu'à 8 à 10 × 106 ml-1 de cellules dans un flacon Erlenmeyer en polypropylène à fond plat ventilé de 2 L, puis stérilisé avec une concentration finale de 500 µM de CuSO4 (Millipore Sigma) et filtré stérilement.induit.Les cultures induites ont été incubées à 27°C à 120 tr/min pendant quatre jours.
Le milieu conditionné contenant SPACA6 a été isolé par centrifugation à 5 660 x g à 4 ° C, suivie d'un système de filtration à flux tangentiel Centramate (Pall Corp) avec une membrane MWCO de 10 kDa.Appliquer un milieu concentré contenant SPACA6 sur une colonne de résine d’agarose Ni-NTA (Qiagen) de 2 ml.La résine Ni-NTA a été lavée avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon A, puis 1 CV de tampon A a été ajouté pour donner une concentration finale d'imidazole de 50 mM.SPACA6 a été élué avec 10 ml de tampon A additionné d'imidazole jusqu'à une concentration finale de 500 mM.De la thrombine de classe de restriction (Millipore Sigma) a été ajoutée directement au tube de dialyse (MWCO 12-14 kDa) à raison de 1 unité par mg de SPACA6 contre 1 L de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 et NaCl 150 mM (tampon B) pour la dialyse.) à 4°C pendant 48 heures.Le SPACA6 clivé par la thrombine a ensuite été dilué trois fois pour réduire la concentration en sel et chargé sur une colonne échangeuse de cations MonoS 5/50 GL de 1 ml (Cytiva/GE) équilibrée avec 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5.L'échangeur de cations a été lavé avec 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, puis SPACA6 a été élué avec un gradient linéaire de 0 à 500 mm de NaCl dans 10 mm de Tris-HCl, pH 7,5 pendant 25 OK.Après chromatographie par échange d'ions, SPACA6 a été concentrée à 1 ml et éluée de manière isocratique à partir d'une colonne ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) équilibrée avec le tampon B. Selon le chromatogramme, regrouper et concentrer les fractions contenant SPACA6.La pureté a été contrôlée par électrophorèse colorée au Coomassie sur un gel de SDS-polyacrylamide à 16 %.La concentration en protéines a été quantifiée par absorbance à 280 nm en utilisant la loi de Beer-Lambert et le coefficient d'extinction molaire théorique.
SPACA6 purifié a été dialysé pendant une nuit contre du phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4 et 150 mM de NaF et dilué à 0,16 mg/mL avant analyse par spectroscopie CD.Le balayage spectral de CD d'une longueur d'onde de 185 à 260 nm a été collecté sur un spectropolarimètre Jasco J-1500 en utilisant des cuvettes en quartz avec une longueur de trajet optique de 1 mm (Helma) à 25 °C à une vitesse de 50 nm/min.Les spectres CD ont été corrigés de base, moyennés sur 10 acquisitions et convertis en ellipticité résiduelle moyenne (θMRE) en degrés cm2/dmol :
où MW est le poids moléculaire de chaque échantillon en Da ;N est le nombre d'acides aminés ;θ est l'ellipticité en millidegrés ;d correspond à la longueur du chemin optique en cm ;concentration de protéines en unités.