347 tubes enroulés en acier inoxydable de 12,7 x 1,24 mm, mécanisme moléculaire de condensation électrostatique synchrone et de coagrégation de l'α-synucléine et de la protéine tau

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Spécifications des tuyaux en acier inoxydable 347

Tube enroulé en acier inoxydable 347 12,7 x 1,24 mm.

Diamètre extérieur : 6,00 mm OD jusqu'à 914,4 mm OD, tailles jusqu'à 24" NB disponibles en stock, tubes en acier de taille OD disponibles en stock

Plage d'épaisseur de tuyau SS 347 : 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT : SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Ou taille non régulière à adapter selon les besoins

Type : Tuyaux sans soudure SS 347 |Tuyaux SS 347 REG |Tuyaux soudés SS 347 |Tuyaux fabriqués SS 347 |Tubes SS 347 CDW, tuyaux LSAW / soudés / redessinés

Forme : tuyaux/tubes ronds SS 347, tuyaux/tubes carrés SS 347, tuyaux/tubes rectangulaires SS 347, tubes enroulés SS 347, forme en « U » SS 347, bobines à gâteau SS 347, tubes hydrauliques SS 347

Longueur : simple aléatoire, double aléatoire et longueur requise. Extrémité : extrémité unie, extrémité biseautée, filetée.

Protection des extrémités : capuchons en plastique |Finition extérieure : 2B, No.4, No.1, No.8 Finition miroir pour tuyaux en acier inoxydable, finition selon les exigences du client

État de livraison : recuit et mariné, poli, recuit brillant, étiré à froid

Inspection, rapports d'essai : certificats d'essai d'usine, EN 10204 3.1, rapports chimiques, rapports mécaniques, rapports d'essai PMI, rapports d'inspection visuelle, rapports d'inspection par des tiers, rapports de laboratoire approuvés par NABL, rapport d'essai destructif, rapports d'essai non destructifs

Emballage : emballé dans des boîtes en bois, des sacs en plastique, des bandes d'acier groupées ou selon les demandes des clients

Particularités : des tailles et des spécifications autres que celles ci-dessus peuvent être fabriquées sur demande

Gamme de tailles de tuyaux SS 347 : 1/2 pouce NB, diamètre extérieur à 24 pouces

ASTM A312 347 : Tuyaux austénitiques soudés sans soudure et à joints droits destinés à un service à haute température et corrosif général.Métal d'apport interdit lors du soudage.

ASTM A358 347 : Tuyau austénitique soudé par fusion électrique pour service corrosif et/ou à haute température.Généralement, seuls des tuyaux jusqu'à 8 pouces sont produits selon cette spécification.L'ajout de métal d'apport est autorisé pendant le soudage.

ASTM A790 347 : Tuyaux ferritiques/austénitiques (duplex) soudés sans soudure et à joints droits destinés à un service corrosif général, avec un accent particulier sur la résistance à la fissuration par corrosion sous contrainte.

ASTM A409 347 : Tuyau à paroi légère austénitique de grand diamètre soudé par fusion électrique à joint droit ou en spirale dans des tailles de 14" à 30" avec des parois Sch5S et Sch 10S pour les environnements corrosifs et/ou élevés.

ASTM A376 347 : Tuyau austénitique sans soudure pour applications à haute température.

ASTM A813 347 : Tuyau austénitique à simple ou double soudure pour applications à haute température et corrosives générales.

ASTM A814 347 : Tuyaux austénitiques soudés travaillés à froid pour un service à haute température et corrosif général.

Composition chimique des tuyaux en acier inoxydable 347H

Propriétés mécaniques des tuyaux en acier inoxydable 347H

Propriétés physiques des tuyaux en acier inoxydable 347H

Catégories équivalentes pour les tuyaux en acier inoxydable 347H

L'agrégation de l'alpha-synucléine amyloïde (αS) est une caractéristique de la maladie de Parkinson et d'autres synucléinopathies.Récemment, la protéine tau communément associée à la maladie d'Alzheimer a été associée à la pathologie αS et co-localisée dans des inclusions riches en αS, bien que le mécanisme moléculaire de coagrégation des deux protéines reste flou.Nous rapportons ici que la phase αS se sépare en condensats liquides via une condensation complexe électrostatique avec des polypeptides chargés positivement tels que tau.En fonction de l'affinité de l'αS pour les polycations et du taux de déplétion de valence du réseau de coagulation, les caillots subissent une gélification ou une coalescence rapide suivie d'une lente agrégation amyloïde.En combinant une suite de techniques biophysiques avancées, nous avons pu caractériser la séparation de phase liquide-liquide αS/Tau et identifier les facteurs clés qui conduisent à la formation d’agrégats hétérogènes contenant les deux protéines dans un condensat de protéines liquide.
En plus des compartiments membranaires, la séparation spatiale dans les cellules peut également être obtenue par la formation de corps denses riches en protéines, semblables à des liquides, appelés condensats ou gouttelettes biomoléculaires, grâce à un processus connu sous le nom de séparation de phase liquide-liquide (LLPS).Ces gouttelettes sont formées par des interactions temporelles multivalentes, généralement entre des protéines ou des protéines et de l'ARN, et remplissent diverses fonctions dans presque tous les systèmes vivants.Un grand nombre de protéines capables de LLP présentent des séquences de faible complexité qui sont de nature très désordonnée et dans la formation de condensats biomoléculaires 3,4,5.De nombreuses études expérimentales ont révélé la nature flexible, souvent désordonnée et multivalente des protéines qui composent ces condensats liquides, bien que l'on sache peu de choses sur les déterminants moléculaires spécifiques qui contrôlent la croissance et la maturation de ces condensats en un type plus solide. État..
Les nouvelles données soutiennent l'hypothèse selon laquelle les LLPS aberrantes induites par les protéines et la transformation des gouttelettes en structures solides pourraient être des voies cellulaires pertinentes conduisant à la formation d'agrégats toxiques insolubles qui sont souvent caractéristiques des maladies dégénératives.De nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées (IDP) associées au LLPS, souvent très chargées et flexibles, sont depuis longtemps associées à la neurodégénérescence par le biais du processus d'agrégation amyloïde.En particulier, il a été démontré que les condensats biomoléculaires d'IDP tels que FUS7 ou TDP-438 ou les protéines avec de grands domaines de faible complexité telles que hnRNPA19 vieillissent sous des formes semblables à un gel ou même solides grâce à un processus appelé fluidisation.composé.à une transition de phase solide (LSPT) en fonction du temps ou en réponse à certaines modifications post-traductionnelles ou mutations pathologiquement significatives1,7.
Un autre IDP associé au LLPS in vivo est Tau, une protéine désordonnée associée aux microtubules dont l'agrégation amyloïde a été impliquée dans la maladie d'Alzheimer10 mais a également été récemment impliquée dans la maladie de Parkinson (MP) et d'autres protéinopathies nucléaires synaptiques 11, 12, 13 sont liées.Il a été démontré que Tau se dissocie spontanément de la solution/du cytoplasme en raison d'interactions électrostatiques favorables14, entraînant la formation de gouttelettes enrichies en tau appelées coacervats électrostatiques.Il a également été observé que ce type d’interaction non spécifique est à l’origine de nombreux condensats biomoléculaires dans la nature15.Dans le cas d'une protéine tau, l'agrégation électrostatique peut être formée par une simple agrégation, dans laquelle des régions de charge opposée de la protéine déclenchent le processus de clivage, ou par une agrégation complexe par interaction avec des polymères chargés négativement tels que l'ARN.
Récemment, l'α-synucléine (αS), un IDP amyloïde impliqué dans la MP et d'autres maladies neurodégénératives collectivement connues sous le nom de synucléinopathie17,18, a été démontrée dans des modèles cellulaires et animaux19,20 concentrés dans des condensats de protéines ayant un comportement semblable à celui d'un fluide.Des études in vitro ont montré que l'αS subit une LLPS par simple agrégation via des interactions principalement hydrophobes, bien que ce processus nécessite des concentrations de protéines exceptionnellement élevées et des temps d'incubation atypiquement longs19,21.La question de savoir si les condensats contenant de l'αS observés in vivo sont formés par ce processus ou par d'autres processus LLPS reste une question clé non résolue.De même, bien que l’agrégation amyloïde αS ait été observée dans les neurones de la MP et d’autres synucléinopathies, le mécanisme exact par lequel l’αS subit une agrégation amyloïde intracellulaire reste flou, car la surexpression de cette protéine ne semble pas déclencher ce processus par elle-même.Des dommages cellulaires supplémentaires sont souvent nécessaires, ce qui suggère que certains emplacements cellulaires ou microenvironnements sont nécessaires à la renucléation des assemblages amyloïdes αS intracellulaires.Un environnement cellulaire particulièrement sujet à l'agrégation pourrait être l'intérieur des condensats de protéines 23.
Il est intéressant de noter que αS et tau se localisent dans des inclusions caractéristiques de la maladie chez les humains atteints de la maladie de Parkinson et d'autres synucléinopathies 24,25 et des expériences ont rapporté une relation pathologique synergique entre les deux protéines 26,27, suggérant une relation potentielle entre l'agrégation αS et tau dans les maladies neurodégénératives.maladie.Il a été constaté que αS et tau interagissent et favorisent leur agrégation in vitro et in vivo 28,29 et des agrégats hétérogènes composés de ces deux protéines ont été observés dans le cerveau de patients atteints de synucléinopathies 30.Cependant, on sait peu de choses sur les bases moléculaires de l’interaction entre αS et tau et sur le mécanisme de sa co-agrégation.Il a été rapporté que αS interagit avec tau par le biais d'une attraction électrostatique entre la région C-terminale hautement chargée négativement de αS et la région centrale riche en proline de tau, qui est également enrichie en résidus chargés positivement.
Dans cette étude, nous montrons que l'αS peut effectivement se dissocier en gouttelettes via une condensation complexe électrostatique en présence de protéine tau, contrairement à son interaction avec d'autres polypeptides chargés positivement tels que la poly-L-lysine (pLK), et dans ce processus.αS agit comme une molécule d'échafaudage pour le réseau de gouttelettes.Nous avons identifié des différences notables dans le processus de maturation des coacervats électrostatiques αS, qui sont associées à des différences dans la valence et la force de l'interaction des protéines impliquées dans le réseau de coacervats.Il est intéressant de noter que nous avons observé la co-agrégation des protéines amyloïdes αS et tau dans des coacervats liquides à longue durée de vie et identifié certains facteurs clés conduisant à la co-agrégation de ces deux protéines dans ces coacervats.Nous décrivons ici en détail ce processus, qui constitue un mécanisme moléculaire possible sous-jacent à la colocalisation de deux protéines dans des inclusions spécifiques à une maladie.
αS a une queue C-terminale hautement anionique à pH neutre (Fig. 1a), et nous avons émis l'hypothèse qu'elle pourrait subir une LLPS par condensation de complexes électrostatiques avec des molécules polypeptidiques désordonnées polycationiques.Nous avons utilisé une poly-L-lysine (pLK) de 100 résidus comme molécule modèle de départ en raison de sa nature polymère chargée positivement et désordonnée à pH neutre 32. Tout d'abord, nous avons confirmé que la pLK interagit avec le domaine Ct de αS via la spectroscopie RMN en solution. (Figure 1b) en utilisant αS marqué au 13C/15N en présence de rapports molaires αS : pLK croissants.L'interaction de pLK avec le domaine Ct de αS se manifeste par des perturbations du déplacement chimique et une diminution de l'intensité maximale dans cette région de la protéine.Fait intéressant, lorsque nous avons mélangé αS avec pLK à une concentration d’αS d’env.5 à 25 µM en présence de polyéthylène glycol (5 à 15 % de PEG-8) (tampon LLPS typique : 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 mM de NaCl, 15 % de PEG-8), nous avons immédiatement parcouru un large champ de formation de protéines .les gouttelettes ont été observées par microscopie à fluorescence (WF) et à fond clair (BF) (Fig. 1c).Gouttelettes de 1 à 5 µm contenant de l'αS concentré (ajouté de 1 µM d'αS marqué par AlexaFluor488, AF488-αS), leurs propriétés électrostatiques peuvent être dérivées de leur résistance à 10 % de 1,6-hexanediol (1,6-HD) et de sa sensibilité à une augmentation de la concentration de NaCl (Fig. 1c).La nature fluide des coacervats du complexe électrostatique αS/pLK est démontrée par leur capacité à fusionner en quelques millisecondes (Fig. 1d).En utilisant la turbidimétrie, nous avons quantifié la formation de gouttelettes dans ces conditions, confirmé la nature électrostatique de la principale interaction associée à sa stabilité (Fig. 1e) et évalué l'effet de divers ratios de polymères sur le processus LLPS (Fig. 1f).Bien que la formation de gouttelettes soit observée sur une large gamme de rapports de polymères, le processus est très favorable lorsque pLK est supérieur à αS.Des LLP ont également été observées en utilisant l'agent de déplacement chimiquement différent dextran-70 (70 kDa) ou en utilisant divers formats d'échantillons, notamment des gouttes de lame de verre, des puits de microplaques de divers matériaux, des capillaires Eppendorf ou de quartz.
une représentation schématique de différentes régions protéiques dans les variantes WT-αS et ΔCt-αS utilisées dans cette étude.Le domaine N-terminal amphipathique, la région de formation d'amyloïde hydrophobe (NAC) et le domaine C-terminal chargé négativement sont représentés respectivement en bleu, orange et rouge.La carte de charge nette par résidu (NCPR) de WT-αS est affichée.b Analyse RMN de l'interaction αS/pLK en l'absence d'amas macromoléculaires.À mesure que la concentration de pLK augmente (les rapports molaires αS:pLK de 1:0,5, 1:1,5 et 1:10 sont indiqués respectivement en vert clair, vert et vert foncé).c Coacervat αS/pLK (rapport molaire 1:10) à 25 µM (1 µM de αS marqué par AF488 ou pLK marqué par Atto647N pour l'imagerie WF) dans un tampon LLPS (en haut) ou complété avec 500 mM de NaCl (en bas à gauche) ou après 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD ; en bas à droite).Barre d’échelle = 20 µm.d Images microscopiques représentatives de la fusion de gouttelettes BF de αS/pLK (rapport molaire 1:10) à une concentration de 25 μM ;les flèches indiquent la fusion de gouttes individuelles (flèches rouges et jaunes) en une nouvelle goutte (flèche orange) dans un délai de 200 ms).Barre d’échelle = 20 µm.e Agrégation αS/pLK par diffusion de la lumière (à 350 nm) dans le tampon LLPS avant et après ajout de 500 mM de NaCl ou de 10 % de 1,6-HD à 25 µM αS (N = 3 répétitions d'échantillon, moyenne et écart type également indiqués).f Image BF (en haut) et analyse de diffusion de la lumière (à 350 nm, en bas) de l’agrégation αS/pLK à 25 μM αS avec un rapport molaire αS:pLK croissant (N = 3 répétitions d’échantillons, moyenne et écart type également indiqués).Barre d'échelle = 10 µm.La barre d'échelle sur une image indique l'échelle de toutes les images dans un panneau.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Sur la base de nos observations de condensation du complexe électrostatique αS/pLK et des observations précédentes de αS en tant que molécule cliente du condensat tau/ARN par interaction directe avec tau31, nous avons émis l'hypothèse que αS et tau pourraient co-ségréger avec le solvant en l'absence d'ARN. condensation.via des complexes électrostatiques, et αS est la protéine d'échafaudage dans les coacervats αS/Tau (voir la distribution de charge de tau sur la figure 2e).Nous avons observé que lorsque 10 μM d'αS et 10 μM de Tau441 (contenant respectivement 1 μM d'AF488-αS et 1 μM d'Atto647N-Tau) étaient mélangés dans un tampon LLPS, ils formaient facilement des agrégats de protéines contenant les deux protéines, comme le montre la microscopie WF.(Fig. 2a).La colocalisation des deux protéines dans les gouttelettes a été confirmée par microscopie confocale (CF) (Fig. 1a supplémentaire).Un comportement similaire a été observé lorsque le dextrane-70 était utilisé comme agent d'agrégation (Fig. 1c supplémentaire).En utilisant du PEG ou du dextrane marqué au FITC, nous avons constaté que les deux agents de surpopulation étaient uniformément répartis dans les échantillons, ne montrant ni ségrégation ni association (Fig. 1d supplémentaire).Cela suggère plutôt que dans ce système, ils favorisent la séparation de phases via des effets d’encombrement macromoléculaires, puisque le PEG est un agent d’encombrement préférentiellement stable, comme on le voit dans d’autres systèmes LLP33,34.Ces gouttelettes riches en protéines étaient sensibles au NaCl (1 M) mais pas au 1,6-HD (10 % v/v), confirmant leurs propriétés électrostatiques (Fig. Supplémentaire 2a, b).Leur comportement fluide a été confirmé en observant des événements de fusion de gouttelettes en millisecondes à l'aide de la microscopie BF (Fig. 2b).
une images de microscopie confocale (CF) de coacervats αS/Tau441 dans un tampon LLPS (10 μM de chaque protéine, 0,5 μM d'αS marqué par AF488 et de Tau441 marqué par Atto647N).b Images représentatives de contraste interférentiel différentiel (DIC) des événements de fusion de gouttelettes αS/Tau441 (10 μM pour chaque protéine).c Diagramme de phase basé sur la diffusion de la lumière (à 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) en l'absence (à gauche) ou en présence (à droite) de 50 µM d'αS.Les couleurs plus chaudes indiquent une plus grande diffusion.d Diffusion de la lumière des échantillons αS/Tau441 LLPS avec une concentration croissante en αS (Tau441 à 5 µM, N = 2 à 3 répétitions d'échantillons comme indiqué).e Représentation schématique de certaines variantes de la protéine tau et de différentes régions de la protéine utilisée dans cette étude : domaine N-terminal chargé négativement (rouge), région riche en proline (bleu), domaine de liaison aux microtubules (MTBD, surligné en orange) et spirale de paire formant amyloïde.régions de filaments (PHF) situées dans le MTBD (gris).La carte de charge nette par résidu (NCPR) de Tau441 est affichée.f En utilisant 1 µM d'αS marqué par AF488 et de ΔNt- marqué par Atto647N, en utilisant 1 µM d'αS ou ΔCt-αS marqué par AF488 en présence de ΔNt-Tau (en haut, 10 µM par protéine) ou de K18 (en bas, 50 µM par protéine) ) ) ) micrographies de WF condensées dans du tampon LLPS ou K18.Les barres d’échelle dans une image représentent l’échelle de toutes les images dans un panneau (20 µm pour les panneaux a, b et f).Les données brutes des panels c et d sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Pour tester le rôle de αS dans ce processus LLPS, nous avons d'abord étudié l'effet de αS sur la stabilité des gouttelettes par néphélométrie en utilisant des concentrations croissantes de NaCl (Fig. 2c).Plus la concentration en sel dans les échantillons contenant de l'αS est élevée, plus les valeurs de diffusion de la lumière sont élevées (à 350 nm), ce qui indique le rôle stabilisateur de l'αS dans ce système LLPS.Un effet similaire peut être observé en augmentant la concentration en αS (et donc le rapport αS:Tau441) à env.Augmentation de 10 fois par rapport à la concentration de tau (5 µM) (Fig. 2d).Pour démontrer que αS est une protéine d'échafaudage dans les coacervats, nous avons décidé d'étudier le comportement du mutant Tau perturbé par le LLPS, dépourvu d'une région N-terminale chargée négativement (résidus 1 à 150, voir Fig. 2e) appelée ΔNt-Tau.La microscopie WF et la néphélométrie ont confirmé que ΔNt-Tau lui-même n'a pas subi de LLPS (Fig. 2f et Fig. 2d supplémentaire), comme indiqué précédemment 14. Cependant, lorsque αS a été ajouté aux solutions de dispersion de cette variante de Tau tronquée, le processus LLPS a été complètement restauré avec une densité de gouttelettes proche de la densité de gouttelettes de solutions grandeur nature de Tau et αS dans des conditions et des concentrations de protéines similaires.Ce processus peut également être observé dans des conditions de faible encombrement macromoléculaire (Fig. 2c supplémentaire).Le rôle de la région αS C-terminale, mais pas de toute sa longueur, dans le processus LLPS a été démontré par l'inhibition de la formation de gouttelettes à l'aide d'un variant αS tronqué C-terminal dépourvu des résidus 104-140 (Fig. 1a) du (ΔCt- αS) (Fig. 2f et Fig. 2d supplémentaire).La colocalisation de αS et ΔNt-Tau a été confirmée par microscopie confocale à fluorescence (Fig. 1b supplémentaire).
Pour tester davantage le mécanisme LLPS entre Tau441 et αS, une variante supplémentaire de Tau a été utilisée, à savoir le fragment de noyau de filament hélicoïdal (PHF) apparié dans le domaine de liaison aux microtubules (MTBD), qui, s'il contient quatre domaines de répétition caractéristiques, communément également appelés comme le fragment K18 (voir Fig. 2e).Il a récemment été rapporté que αS se liait préférentiellement à une protéine tau située dans un domaine riche en proline dans une séquence précédant le domaine de liaison aux microtubules.Cependant, la région PHF est également riche en résidus chargés positivement (voir Figure 2e), notamment en lysine (15 % de résidus), ce qui nous a incité à tester si cette région contribue également à la condensation du complexe αS/Tau.Nous avons observé que le K18 seul ne pouvait pas déclencher le LLPS à des concentrations allant jusqu'à 100 µM dans les conditions testées (tampon LLPS avec 15 % de PEG ou 20 % de dextrane) (Figure 2f).Cependant, lorsque nous avons ajouté 50 µM d'αS à 50 µM de K18, la formation rapide de gouttelettes de protéines contenant du K18 et de l'αS a été observée par néphélométrie (Fig. 2d supplémentaire) et par microscopie WF (Fig. 2f).Comme prévu, ΔCt-αS n'a pas pu restaurer le comportement LLPS de K18 (Fig. 2f).Nous notons que l’agrégation αS/K18 nécessite des concentrations de protéines légèrement plus élevées pour induire le LLPS par rapport à αS/ΔNt-Tau ou αS/Tau441, toutes choses étant égales par ailleurs.Ceci est cohérent avec une interaction plus forte de la région C-terminale αS avec le domaine Tau riche en proline par rapport au domaine de liaison aux microtubules, comme décrit précédemment 31 .
Étant donné que ΔNt-Tau ne peut pas effectuer de LLPS en l'absence de αS, nous avons choisi cette variante de Tau comme modèle pour caractériser αS/Tau LLPS compte tenu de sa simplicité dans les systèmes LLPS avec Tau complet (isotype, Tau441/Tau441).avec des processus d’agrégation complexes (hétérotypiques, αS/Tau441).Nous avons comparé le degré d'agrégation de αS (dans le cadre de la protéine en phase condensée, fαS, c) dans les systèmes αS/Tau et αS/ΔNt-Tau par centrifugation et analyse SDS-PAGE en phase dispersée (voir 2e), et avons trouvé des valeurs très similaires. ​​pour toutes les protéines à la même concentration.En particulier, nous avons obtenu fαS,c 84 ± 2 % et 79 ± 7 % pour αS/Tau et αS/ΔNt-Tau, respectivement, ce qui suggère que l'interaction hétérotypique entre αS et tau est supérieure à l'interaction entre les molécules de tau.entre.
L'interaction avec divers polycations et l'effet du processus de condensation sur la cinétique de l'αS ont d'abord été étudiés par la méthode de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP).Nous avons testé les coacervats αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau et αS/pLK (100 μM d'αS complétés par 2 μM d'αS AF488-αS et 100 μM de Tau441 ou ΔNt-Tau ou 1 mM de pLK).Les données ont été obtenues dans les 30 premières minutes après le mélange des composants de l’échantillon.À partir d'images FRAP représentatives (Fig. 3a, condensation αS / Tau441) et de leurs courbes temporelles correspondantes (Fig. 3b, Fig. 3 supplémentaire), on peut voir que la cinétique αS est très similaire à celle des coacervats Tau441.et ΔNt-Tau, qui est beaucoup plus rapide avec pLK.Les coefficients de diffusion calculés pour αS à l'intérieur du coacervat selon FRAP (tel que décrit par Kang et al. 35) sont D = 0,013 ± 0,009 µm2/s et D = 0,026 ± 0,008 µm2/s pour αS/Tau441 et αS/ΔNt- pour le système αS/.pLK, Tau et D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectivement (Fig. 3c).Cependant, le coefficient de diffusion αS dans la phase dispersée est supérieur de plusieurs ordres de grandeur à celui de toutes les phases condensées, tel que déterminé par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS, voir Fig. 3 supplémentaire) dans les mêmes conditions (tampon LPPS) mais en l'absence de polycations. (D = 8 ± 4 µm2/s).Par conséquent, la cinétique de traduction de αS est considérablement réduite dans les coacervats par rapport aux protéines en phase dispersée en raison d’effets d’encombrement moléculaire prononcés, bien que tous les coacervats conservent des propriétés semblables à celles d’un liquide pendant la première demi-heure suivant leur formation, contrairement à la phase tau.cinétique plus rapide dans le condensat pLK.
Analyse a – c FRAP de la dynamique de l'αS (αS marqué à 2 % par AF488) dans les coacervats électrostatiques.Des images représentatives des tests αS/Tau441 FRAP en triple exemplaire sont présentées en (a), où les cercles rouges indiquent les zones décolorées.La barre d'échelle est de 5 µm.b Courbes FRAP moyennes et (c) coefficients de diffusion calculés (D) pour 5 à 6 (N) gouttelettes différentes provenant de trois expériences utilisant 100 µM αS et des concentrations équimolaires de Tau441 (rouge) ou ΔNt-Tau (bleu) ou pLK (vert) à dix fois la concentration de LLPS.L'écart type de la courbe FRAP est affiché en couleur ombrée.À titre de comparaison, le coefficient de diffusion αS dans la phase dispersée a été déterminé en triple par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) (voir la Figure 3 supplémentaire et les méthodes pour plus d'informations).d Spectres EPR continus en bande X de 100 μM de TEMPOL-122-αS dans un tampon LLPS sans aucun polycation (noir) ou en présence de 100 μM de Tau441 (rouge) ou de ΔNt-Tau (bleu) ou de 1 mM de pLK (vert).L'encart montre une vue agrandie des lignes de champ intenses où se produisent les changements les plus spectaculaires.e Courbes de liaison du TEMPOL-122-αS 50 μM avec divers polycations en l'absence de LLPS (pas de PEG).Il est démontré que l’amplitude réduite de la bande III par rapport à la bande II (IIII/III) du spectre EPR normalisé augmente les rapports molaires de Tau441 (rouge), ΔNt-Tau (bleu) et pLK (vert).Les lignes colorées montrent l'ajustement aux données à l'aide d'un modèle de liaison approximatif avec n sites de liaison identiques et indépendants sur chaque courbe.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
En complément, nous avons étudié la dynamique de l'αS dans divers coacervats en utilisant le marquage de spin dirigé (SDSL) et la résonance paramagnétique électronique continue (CW-EPR).Cette méthode s'est avérée très utile pour rendre compte de la flexibilité et de la dynamique de l'IDP avec une résolution résiduelle réaliste36,37,38.À cette fin, nous avons construit des résidus de cystéine dans des mutants Cys simples et utilisé la sonde de spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-N-oxyl (TEMPOL).Les dérivés du maléimide les étiquettent.Plus précisément, nous avons inséré des sondes TEMPOL en position 122 ou 24 αS (TEMPOL-122-αS et TEMPOL-24-αS).Dans le premier cas, nous ciblons la région C-terminale de la protéine, impliquée dans l'interaction avec les polycations.Au lieu de cela, la position 24 peut nous donner des informations sur la dynamique globale des protéines présentes dans le condensat.Dans les deux cas, les signaux RPE obtenus pour les protéines de la phase dispersée correspondaient à des radicaux nitroxyde en mouvement rapide.Après séparation de phase en présence de tau ou de pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ou ΔNt-Tau dans un rapport de 1:1 ou pLK dans un rapport de 1:10), une augmentation de l'intensité relative du pic a été observée dans le spectre EPR de αS.La ligne de perte s'est élargie, indiquant une cinétique de réorientation αS réduite dans les gouttelettes par rapport à la protéine en phase diluée (Fig. 3d, Fig. 4a supplémentaire).Ces changements sont plus prononcés à la position 122. Alors qu'à la position 24, la présence de pLK n'affectait pas la cinétique de la sonde, à la position 122, la forme de la raie spectrale a changé de manière significative (Fig. 4a supplémentaire).Lorsque nous avons tenté de modéliser les spectres en position 122 de deux systèmes αS / polycation à l'aide du modèle isotrope (Figure 5a supplémentaire) couramment utilisé pour décrire la dynamique de l'IDP38, 39 marqué par spin, nous n'avons pas pu reconstruire les spectres expérimentaux..Simulation spectrale de la position des contrastes de 24 spins (Fig. 5a supplémentaire).Ceci suggère qu'il existe des positions préférentielles dans l'espace des configurations de spin de la région C-terminale de αS en présence de polycations.Lorsque l'on considère la fraction d'αS dans la phase condensée dans des conditions expérimentales de RPE (84 ± 2 %, 79 ± 7 % et 47 ± 4 % pour αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau et αS/pLK, respectivement - voir Supplémentaire Fig. 2e de l'analyse des données c), on peut voir que l'élargissement détecté par la méthode EPR reflète principalement l'interaction de la région C-terminale de αS avec divers polycations dans la phase condensée (le principal changement lors de l'utilisation de TEMPOL-122- αS), et non la condensation des protéines.Une augmentation de la microviscosité est observée dans la sonde.Comme prévu, le spectre EPR de la protéine dans des conditions autres que LLPS a été complètement restauré lorsque du NaCl 1 M a été ajouté au mélange (Fig. 4b supplémentaire).Dans l'ensemble, nos données suggèrent que les changements détectés par CW-EPR reflètent principalement l'interaction de la région C-terminale de αS avec divers polycations dans la phase condensée, et cette interaction semble être plus forte avec pLK qu'avec Tau.
Afin d'obtenir plus d'informations structurelles sur les protéines du coacervat, nous avons décidé d'étudier le système LLPS par RMN en solution.Cependant, nous n’avons pu détecter que la fraction αS restant dans la phase dispersée, ce qui peut être dû à une dynamique réduite des protéines à l’intérieur du coacervat et à une phase dense au fond de la solution lors de l’analyse RMN.Lorsque nous avons analysé la structure et la dynamique de la protéine restant dans la phase dispersée de l'échantillon LLPS par RMN (Fig. 5c, d supplémentaires), nous avons remarqué que la protéine se comportait presque de la même manière en présence de pLK et de ΔNt-Tau, tous deux de qui étaient dans la structure secondaire et la dynamique du squelette protéique, révélés par des expériences sur le déplacement chimique secondaire et la relaxation R1ρ.Les données RMN montrent que l'extrémité C-terminale de αS subit une perte significative de flexibilité conformationnelle tout en conservant sa nature désordonnée, comme le reste de la séquence protéique, en raison de ses interactions avec les polycations.
Étant donné que l'élargissement du signal CW-EPR observé dans la phase condensée de TEMPOL-122-αS reflète l'interaction de la protéine avec des polycations, nous avons effectué un titrage EPR pour évaluer l'affinité de liaison de αS à divers polycations en l'absence de LLPS (pas d'accumulation de Buffer LLPS), suggérant que les interactions sont les mêmes dans les phases diluée et concentrée (ce qui est confirmé par nos données, Fig. 4a supplémentaire et Fig. 6 supplémentaire).L’objectif était de voir si tous les coacervats, malgré leurs propriétés fluides communes, présentent un comportement différentiel sous-jacent au niveau moléculaire.Comme prévu, le spectre EPR s'est élargi avec l'augmentation de la concentration de polycations, reflétant une diminution de la flexibilité moléculaire due aux interactions moléculaires de tous les partenaires d'interaction presque jusqu'à saturation (Fig. 3e, Fig. 6 supplémentaire).pLK a atteint cette saturation avec un rapport molaire (polycation: αS) inférieur à celui de ΔNt-Tau et Tau441.En fait, la comparaison des données avec un modèle de liaison approximatif supposant n sites de liaison identiques et indépendants a montré que la constante de dissociation apparente de pLK (~ 5 μM) est d'un ordre de grandeur inférieure à celle de Tau441 ou ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Bien qu’il s’agisse d’une estimation approximative, cela suggère que αS a une plus grande affinité pour les polycations plus simples avec des régions de charge positive continue.Compte tenu de cette différence d’affinité entre αS et divers polycations, nous avons émis l’hypothèse que leurs propriétés liquides pourraient changer différemment au fil du temps et souffrir ainsi de différents processus LSPT.
Compte tenu de l’environnement très encombré au sein du coacervat protéique et de la nature amyloïde de la protéine, nous avons observé le comportement du coacervat au fil du temps afin de détecter d’éventuels processus LSPT.En utilisant les microscopies BF et CF (Figure 4), nous avons observé que αS/Tau441 coacerve dans une large mesure en solution, formant de grosses gouttelettes qui entrent en contact et mouillent la surface au fond du puits/de la lame sous forme de gouttelettes pleines, comme prévu (Fig. supplémentaire .7d);nous appelons ces structures formées au fond des « radeaux protéiques ».Ces structures sont restées fluides car elles conservaient la capacité de fusionner (Fig. 7b supplémentaire) et pouvaient être observées pendant plusieurs heures après le déclenchement du LLPS (Fig. 4 et Fig. 7c supplémentaire).Nous avons observé que le processus de mouillage est favorisé à la surface des matériaux hydrophiles plutôt qu'hydrophobes (Fig. 7a supplémentaire), comme prévu pour les coacervats électrostatiques présentant des charges déséquilibrées et donc des potentiels de surface électrostatiques élevés.Notamment, la coalescence et le rafting αS/ΔNt-Tau ont été considérablement réduits, tandis que les condensats αS/pLK ont été considérablement réduits (Fig. 4).Pendant la courte période d'incubation, les gouttelettes αS/pLK ont pu fusionner et mouiller la surface hydrophile, mais ce processus s'est rapidement arrêté et après 5 heures d'incubation, seuls des événements de coalescence limités et aucun mouillage n'ont été observés.– transition gel-goutte à goutte.
BF représentatifs (panneaux en niveaux de gris) et CF (panneaux de droite, αS marqué par AF488 en vert) d'échantillons de coacervat contenant 100 µM d'αS (marqueur fluorescent à 1 %) dans un tampon LLPS en présence de 100 µM de fluorescence Tau441 (en haut)) images microscopiques ΔNt -Tau (centre) ou 1 mM pLK (en bas) à différents temps d'incubation et hauteurs focales (z, distance du fond du puits de plaque).Les expériences ont été répétées 4 à 6 fois indépendamment les unes des autres avec les mêmes résultats.Les coacervats αS/Tau441 sont mouillés après 24 heures, formant des radeaux plus grands que l'image.La barre d'échelle pour toutes les images est de 20 µm.
Nous avons ensuite demandé si les grands pools de protéines fluides formés dans le αS/Tau441 LLPS conduiraient à une agrégation amyloïde de l’une des protéines étudiées.Nous avons suivi la maturation des gouttelettes d'αS / Tau441 au fil du temps avec la microscopie WF dans les mêmes conditions que ci-dessus, mais en utilisant αS marqué à 1 µM par AF488 et Tau441 marqué par Atto647N (Fig. 5a).Comme prévu, nous avons observé une localisation complète des protéines tout au long du processus de maturation.Fait intéressant, à partir de ca.Au bout de 5 heures, des structures non circulaires plus intenses ont été observées à l'intérieur des radeaux, que nous avons appelées « points », dont certaines étaient colocalisées avec αS et d'autres enrichies en Tau441 (Fig. 5a, flèches blanches).Ces taches ont toujours été observées dans les radeaux dans une plus grande mesure pour αS/ΔNt-Tau que pour αS/ΔNt-Tau.Il n’y avait aucune tache distincte dans les gouttelettes des systèmes pLK et Tau incompétents pour la fusion/mouillage.Pour tester si ces taches contenant αS et Tau441 sont des agrégats de type amyloïde, nous avons réalisé une expérience similaire en utilisant la microscopie CF dans laquelle Tau441 a été marqué avec Atto647N et 12,5 μM de thioflavine-T (ThT) spécifique de l'amyloïde ont été ajoutés dès le début.colorant.Bien que la coloration ThT des gouttelettes ou des radeaux de αS / Tau441 n'ait pas été observée même après 24 h d'incubation (Fig. 5b, rangée du haut - gouttelettes restantes sur les radeaux de protéines), les structures ThT-positives contenant Atto647N-Tau441 à l'intérieur des radeaux étaient très faibles.cela reproduit la taille, la forme et l'emplacement des taches décrites précédemment (Fig. 5b, rangées du milieu et du bas), ce qui suggère que les taches peuvent correspondre à des agrégats de type amyloïde formés dans des coacervats fluides vieillissants.
WF 25 μM αS à différents temps d'incubation et hauteurs focales (z, distance du fond non lié) en présence de 25 μM de Tau441 (1 μM d'αS marqué par AF488 et de Tau441 marqué par Atto647N) dans un puits d'une plaque de microscope avec tampon LLPS) .Six expériences ont été répétées indépendamment avec des résultats similaires.b Image microscopique CF de 25 μM αS en présence de 25 μM de Tau441 (1 μM de Tau441 marqué par Atto647N) et de 12,5 μM de thioflavine-T (ThT).Les gouttelettes de protéines pondérées et les radeaux et taches de protéines déposés sont affichés respectivement dans les rangées du haut et du milieu.La rangée du bas montre des images de radeaux et de chutes provenant de 3 répétitions indépendantes.Les flèches blanches indiquent les points ThT-positifs dans les deux panneaux.La barre d'échelle pour toutes les images est de 20 µm.
Pour examiner plus en détail les modifications intervenues dans le réseau protéique du coacervat lors de la transition du liquide au solide, nous avons utilisé l'imagerie à vie par fluorescence (FLIM) et la microscopie à transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) (Figure 6 et Figures supplémentaires 8 et 9).Nous avons émis l'hypothèse que la maturation coacervatée de la couche en une structure protéique agrégée plus condensée, voire solide, conduit à un contact plus étroit entre la protéine et la sonde fluorescente qui y est attachée, produisant potentiellement un effet d'extinction se manifestant par une durée de vie raccourcie de la sonde (τ). , comme décrit précédemment40.,41,42.De plus, pour les échantillons doublement marqués (AF488 et Atto647N comme colorants donneurs et accepteurs de FRET, respectivement), cette diminution de τ peut également s'accompagner d'une condensation de coacervat et d'une augmentation de l'efficacité de FRET (E) pendant le LSPT.Nous avons surveillé la formation de radeaux et de taches au fil du temps dans des échantillons LLPS αS/Tau441 et αS/ΔNt-Tau (25 µM de chaque protéine dans un tampon LLPS contenant 1 µM d'AF488 marqué αS et/ou Atto647N marqué Tau441 ou ΔNt-Tau).Nous avons observé une tendance générale selon laquelle la durée de vie de fluorescence des sondes AF488 (τ488) et Atto647N (τ647N) diminuait légèrement à mesure que les coacervats mûrissaient (Fig. 6 et Fig. 8c supplémentaire).Il est intéressant de noter que ce changement était significativement accru pour les points situés à l'intérieur des radeaux (Fig. 6c), ce qui indique qu'une condensation supplémentaire des protéines s'est produite au niveau des points.À l'appui de cela, aucun changement significatif dans la durée de vie de la fluorescence n'a été observé pour les gouttelettes αS/ΔNt-Tau vieillies pendant 24 h (Fig. 8d supplémentaire), ce qui suggère que la gélification des gouttelettes est un processus distinct du repérage et qui ne s'accompagne pas d'une réorganisation moléculaire significative. au sein des coacervats.Il convient de noter que les points ont des tailles différentes et un contenu variable dans αS, en particulier pour le système αS/Tau441 (Fig. 8e supplémentaire).La diminution de la durée de vie de la fluorescence ponctuelle s'est accompagnée d'une augmentation de l'intensité, en particulier pour le Tau441 marqué par Atto647N (Fig. 8a supplémentaire), et d'une efficacité FRET plus élevée pour les systèmes αS/Tau441 et αS/ΔNt-Tau, indiquant une condensation supplémentaire dans le LLPS. Cinq heures après le déclenchement, les protéines contenues dans l'électricité statique se sont condensées.Par rapport à αS/ΔNt-Tau, nous avons observé des valeurs de τ647N plus faibles et des valeurs de τ488 légèrement plus élevées dans les spots αS/Tau441, accompagnées de valeurs de FRET plus faibles et plus inhomogènes.Cela pourrait peut-être être lié au fait que dans le système αS / Tau441, l'abondance de αS observée et attendue dans les agrégats est plus hétérogène, souvent sous-stoechiométrique par rapport à Tau, puisque Tau441 lui-même peut également subir une LLPS et une agrégation (Fig. 8e supplémentaire). .Cependant, le degré de coalescence des gouttelettes, de formation de radeaux et, surtout, d'agrégation de protéines au sein de coacervats liquides est maximal lorsque Tau441 et αS sont présents.
a Images de microscopie à fluorescence à vie (FLIM) de αS/Tau441 et αS/ΔNt-Tau à 25 μM de chaque protéine (1 μM d'αS marqué par AF488 et 1 μM de Tau441 ou ΔNt-Tau marqué par Atto647N) dans un tampon LLPS.Les colonnes montrent des images représentatives d’échantillons LLPS à différents temps de maturation (30 min, 5 h et 24 h).Le cadre rouge montre la région contenant les spots αS/Tau441.Les durées de vie sont représentées sous forme de barres de couleur.Barre d'échelle = 20 µm pour toutes les images.b Image FLIM agrandie de la zone sélectionnée, affichée dans le cadre rouge du panneau a.Les plages de vie sont représentées en utilisant la même échelle de couleurs que dans le panneau a.Barre d'échelle = 5 µm.c Histogrammes montrant AF488 (attaché à αS) ou Atto647N (attaché à Tau) pour différentes espèces de protéines (gouttelettes-D-, radeau-R- et speckle-P) identifiées dans les images FLIM enregistrées pour αS-) distributions temporelles de durée de vie de Tau441 et Échantillons de coacervat αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI pour D, 29-44 ROI pour R et 21-51 ROI pour les points).Les valeurs moyennes et médianes sont affichées respectivement sous forme de carrés jaunes et de lignes noires à l’intérieur des cases.Les limites inférieure et supérieure de la boîte représentent respectivement les premier et troisième quartiles, et les valeurs minimales et maximales dans l'intervalle interquartile (IQR) de 1,5 fois sont affichées sous forme de moustaches.Les valeurs aberrantes sont représentées par des losanges noirs.La signification statistique entre les paires de distributions a été déterminée à l'aide d'un test t à deux échantillons, en supposant des variances inégales.Les valeurs p du test t bilatéral sont affichées avec des astérisques pour chaque paire de données comparées (* valeur p > 0,01, ** valeur p > 0,001, *** valeur p > 0,0001, **** valeur p > 0,00001), ns Indique un caractère négligeable (valeur p > 0,05).Les valeurs p exactes sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1 et les données originales sont présentées sous forme de fichiers de données brutes.
Pour démontrer davantage la nature amyloïde des taches/agrégats, nous avons traité des échantillons de coacervats non colorés pendant 24 heures avec des concentrations élevées de NaCl (1 M), ce qui a entraîné la séparation des agrégats des coacervats protéiques.Lorsque des agrégats isolés (c'est-à-dire une solution dispersée d'agrégats) ont été observés en utilisant la microscopie à force atomique (AFM), nous avons observé une morphologie principalement sphérique avec une hauteur régulière d'environ 15 nm, qui a tendance à s'associer dans des conditions de concentration élevée en sel, similaire à le comportement des fibrilles amyloïdes typiques en raison du fort effet hydrophobe sur la surface (notez que les fibrilles ont généralement une hauteur d'environ 10 nm) (Fig. 10a supplémentaire).Il est intéressant de noter que lorsque des agrégats isolés ont été incubés avec du ThT dans un test de fluorescence ThT standard, nous avons observé une augmentation spectaculaire du rendement quantique de fluorescence du ThT, comparable à celle observée lorsque le colorant était incubé avec des fibrilles amyloïdes αS typiques (Fig. 10b supplémentaire), ce qui suggère que les agrégats de coacervat contiennent des structures de type amyloïde..En fait, les agrégats étaient tolérants à des concentrations élevées de sel mais sensibles au chlorure de guanidine 4 M (GdnHCl), comme les fibrilles amyloïdes typiques (Fig. 10c supplémentaire).
Ensuite, nous avons analysé la composition des agrégats en utilisant la fluorescence d'une molécule unique, la spectroscopie de corrélation de fluorescence spécifique/corrélation croisée (FCS/FCCS) et l'analyse en rafale de détection de coïncidence bicolore (TCCD).À cette fin, nous avons isolé les agrégats formés après 24 heures d'incubation dans 100 μl d'échantillons LLPS contenant αS et Tau441 (tous deux 25 μM) ainsi que 1 μM d'αS marqué par AF488 et 1 μM de Tau441 marqué par Atto647N.Diluer la solution d’agrégats dispersés résultante à un état monomoléculaire en utilisant le même tampon sans PEG et 1 M NaCl (le même tampon utilisé pour séparer les agrégats du coacervat) pour éviter toute interaction électrostatique possible entre le LLPS et la protéine.Un exemple de la trajectoire temporelle d'une seule molécule peut être vu sur la figure 7a.L'analyse FCCS/FCS (corrélation croisée, CC et autocorrélation, AC) a montré que les agrégats contenant αS et tau étaient abondants dans les échantillons (voir courbe CC sur la figure 7b, panneau de gauche) et qu'un excès de protéine monomère résiduelle apparaissait sous la forme d'un excès de protéine monomère résiduelle. résultat du processus de dilution (voir les courbes AC sur la figure 7b, panneau de gauche).Les expériences de contrôle réalisées dans les mêmes conditions de solution en utilisant des échantillons contenant uniquement des protéines monomères n'ont montré aucune courbe CC et les courbes AC correspondent bien au modèle de diffusion à un composant (équation 4), dans lequel les protéines monomères ont les coefficients de diffusion attendus (Fig. 7b). ), panneau de droite).Le coefficient de diffusion des particules agrégées est inférieur à 1 µm2/s, et celui des protéines monomères est d'environ 1 µm2/s.50 à 100 µm/s ;les valeurs sont similaires aux valeurs publiées précédemment pour les fibrilles amyloïdes αS soniquées et l'αS monomère séparément dans des conditions de solution similaires44.Lorsque nous avons analysé les agrégats avec l'analyse d'explosion TCCD (Fig. 7c, panneau supérieur), nous avons constaté que dans chaque agrégat isolé (hétéroagrégat αS/Tau), environ 60 % des agrégats détectés contenaient à la fois αS et tau, environ 30 % ne contenaient que tau, environ 10% αS seulement.L'analyse stœchiométrique des hétéroagrégats αS/Tau a montré que la plupart des hétéroagrégats étaient enrichis en tau (stoechiométrie inférieure à 0,5, le nombre moyen de molécules tau par agrégat est 4 fois supérieur à celui des molécules αS), ce qui est cohérent avec nos travaux observés dans FLIM in situ. expériences..L'analyse FRET a montré que ces agrégats contenaient les deux protéines, bien que les valeurs réelles de FRET dans ce cas ne soient pas d'une grande importance, puisque la distribution des fluorophores dans chaque agrégat était aléatoire en raison d'un excès de protéine non marquée utilisée dans l'expérience.Fait intéressant, lorsque nous avons effectué la même analyse en utilisant le variant Tau mature déficient en agrégation amyloïde 45,46 (voir Fig. 11a, b supplémentaire), nous avons remarqué que bien que l'agrégation électrostatique αS soit la même (Fig. 11c, d supplémentaire), la capacité à former des agrégats au sein du coacervat a été considérablement réduite et FLIM a détecté plusieurs points lors d'expériences in situ, et de faibles courbes de corrélation croisée ont été observées pour des échantillons d'agrégats isolés.Cependant, pour un petit nombre d'agrégats détectés (seulement un dixième de Tau441), nous avons observé que chaque agrégat était enrichi en αS par rapport à cette variante de Tau, avec environ 50 % des agrégats détectés contenant uniquement des molécules αS, et αS était en excès hétérogène. .agrégats (voir Fig. 11e supplémentaire), contrairement aux agrégats hétérogènes générés par Tau441 (Fig. 6f).Les résultats de ces expériences ont montré que bien que l'αS lui-même soit capable de s'accumuler avec la tau dans le coacervat, la nucléation de la tau est plus favorable dans ces conditions et les agrégats de type amyloïde résultants sont capables d'agir comme une forme d'αS et de tau.Cependant, une fois qu'un noyau riche en tau est formé, les interactions hétérotypiques entre αS et tau sont favorisées dans les agrégats par rapport aux interactions homotypiques entre les molécules de tau ;nous observons également des réseaux protéiques dans les coacervats liquides αS/tau.
a Traces temporelles de fluorescence représentatives de molécules uniques d'agrégats isolés formés dans des coacervats électrostatiques αS/Tau441.Des sursauts correspondant aux coagrégats αS/Tau441 (sauts supérieurs au seuil indiqué) ont été observés dans trois canaux de détection (émission AF488 et Atto647N après excitation directe, lignes bleues et rouges, émission Atto647N après excitation indirecte), FRET, ligne violette).b Analyse FCS/FCCS d'un échantillon d'agrégats αS/Tau441 isolés obtenus à partir du LLPS (panneau de gauche).Les courbes d'autocorrélation (AC) pour AF488 et Atto647N sont représentées respectivement en bleu et rouge, et les courbes de corrélation croisée (CC) associées aux agrégats contenant les deux colorants sont représentées en violet.Les courbes AC reflètent la présence d'espèces protéiques marquées monomères et agrégées, tandis que les courbes CC montrent uniquement la diffusion d'agrégats doublement marqués.La même analyse, mais dans les mêmes conditions de solution que dans des points isolés, des échantillons contenant uniquement de l'αS monomère et du Tau441 sont présentés comme contrôles dans le panneau de droite.c Analyse flash par fluorescence de molécules uniques d'agrégats isolés formés dans des coacervats électrostatiques αS/Tau441.Les informations pour chaque agrégat trouvé dans quatre répétitions différentes (N = 152) sont comparées à leur stœchiométrie, leurs valeurs S et leur efficacité FRET (panneau supérieur, barre de couleur reflète l'occurrence).Trois types d'agrégats peuvent être distingués : - les agrégats uniquement αS avec S~1 et FRET~0, les agrégats Tau uniquement avec S~0 et FRET~1, et les agrégats Tau/αS hétérogènes avec S et FRET intermédiaires. Estimations de la quantité des deux protéines marqueurs détectées dans chaque agrégat hétérogène (N = 100) sont indiquées dans le panneau inférieur (l'échelle de couleurs reflète l'occurrence).Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Il a été rapporté que la maturation ou le vieillissement des condensats de protéines liquides en structures gélatineuses ou solides au fil du temps est impliqué dans plusieurs fonctions physiologiques du condensat47 ainsi que dans la maladie, en tant que processus anormal précédant l'agrégation amyloïde 7, 48, 49. Ici nous étudions en détail la séparation des phases et le comportement.LSPT αS en présence de polycations aléatoires dans un environnement contrôlé à de faibles concentrations micromolaires et dans des conditions physiologiquement pertinentes (notez que la concentration physiologique calculée de αS est > 1 µM50), suivant le comportement thermodynamique typique du LPS.Nous avons constaté que l'αS, qui contient une région C-terminale fortement chargée négativement à un pH physiologique, est capable de former des gouttelettes riches en protéines en solution aqueuse via LLPS en présence de peptides désordonnés hautement cationiques tels que pLK ou Tau grâce au processus d'électrostatique. condensation complexe en présence de macromolécules d'agrégation.Ce processus peut avoir des effets pertinents dans l'environnement cellulaire où l'αS rencontre diverses molécules polycationiques associées à son agrégation associée à la maladie in vitro et in vivo51,52,53,54.
Dans de nombreuses études, la dynamique des protéines au sein des gouttelettes a été considérée comme l’un des facteurs clés déterminant le processus de maturation55,56.Dans les coacervats électrostatiques αS avec des polycations, le processus de maturation dépend apparemment de la force des interactions avec les polycations, de la valence et de la multiplicité de ces interactions.La théorie de l'équilibre suggère qu'un paysage d'équilibre de deux états liquides serait la présence d'une grosse gouttelette riche en biopolymères qui pilotent le LLPS57,58.La croissance des gouttelettes peut être obtenue par maturation d’Ostwald59, coalescence60 ou consommation de monomère libre dans la phase dispersée61.Pour αS et Tau441, ΔNt-Tau ou pLK, la majeure partie de la protéine était concentrée dans le condensat dans les conditions utilisées dans cette étude.Cependant, alors que les gouttelettes de tau de taille normale fusionnaient rapidement lors du mouillage de la surface, la coalescence et le mouillage des gouttelettes étaient difficiles pour ΔNt-Tau et pLK, suggérant une perte rapide des propriétés du liquide dans ces deux systèmes.Selon notre analyse FLIM-FRET, les gouttelettes âgées de pLK et ΔNt-Tau présentaient un degré d'agrégation de protéines similaire (durée de vie de fluorescence similaire) à celui des gouttelettes d'origine, ce qui suggère que le réseau protéique d'origine a été conservé, bien que plus rigide.
Nous rationalisons nos résultats expérimentaux dans le modèle suivant (Figure 8).Les gouttelettes initialement formées temporairement sont souvent des réseaux de protéines sans compensation électrostatique. Il existe donc des zones de déséquilibre de charge, en particulier à l'interface des gouttelettes, ce qui donne lieu à des gouttelettes présentant un potentiel de surface électrostatique élevé.Pour compenser la charge (phénomène communément appelé déplétion de valence) et minimiser le potentiel de surface des gouttelettes, les gouttelettes peuvent inclure de nouveaux polypeptides de la phase diluée, réorganiser les réseaux protéiques pour optimiser les interactions charge-charge et interagir avec d'autres gouttelettes.avec des surfaces (mouillage).Les gouttelettes αS/pLK, du fait de leur réseau protéique plus simple (uniquement des interactions hétérotypiques entre αS et pLK) et de leur plus grande affinité pour les interactions protéine-protéine, semblent capables d'équilibrer plus rapidement la charge du condensat ;en effet, nous avons observé une cinétique protéique plus rapide dans les coacervats αS/pLK initialement formés que dans αS/Tau.Après l'épuisement de la valence, les interactions deviennent moins éphémères et les gouttelettes perdent leurs propriétés liquides et se transforment en gouttelettes semblables à un gel, ininflammables, avec un faible potentiel de surface électrostatique (et donc incapables de mouiller la surface).En revanche, les gouttelettes αS/Tau sont moins efficaces pour optimiser l’équilibre de charge des gouttelettes en raison de réseaux protéiques plus complexes (avec des interactions homotypiques et hétérotypiques) et de la nature plus faible des interactions protéiques.Il en résulte des gouttelettes qui conservent leur comportement liquide pendant des périodes de temps prolongées et présentent un potentiel de surface électrostatique élevé qui a tendance à être minimisé par la coalescence et la croissance (minimisant ainsi le rapport surface/volume des gouttelettes) et par le mouillage de la substance chimique de surface hydrophile.Cela crée de grandes bibliothèques de protéines concentrées qui conservent les propriétés fluides car les interactions restent très transitoires en raison de la recherche constante d’optimisation de charge dans le réseau protéique.Il est intéressant de noter que les formes tronquées N-terminales de Tau, y compris certaines isoformes naturelles, présentent un comportement intermédiaire, certains coacervats vieillissant avec αS en gouttelettes semblables à un gel à longue durée de vie, tandis que d'autres se transforment en gros condensats liquides.Cette dualité dans la maturation des coacervats électrostatiques αS est cohérente avec les récentes études théoriques et expérimentales du LLPS qui ont identifié une corrélation entre l'appauvrissement de la valence et le tamisage électrostatique dans les condensats comme clé du contrôle de la taille des condensats et des propriétés des fluides.Mécanisme 58.61.
Ce schéma montre la voie putative d’agrégation amyloïde pour αS et Tau441 via LLPS et LSPT.Avec des régions supplémentaires riches en anions (rouge) et en cations (bleu), les coacervats électrostatiques αS et tau avec une valence satisfaisante ont une énergie de surface plus faible et donc moins de coalescence, ce qui entraîne un vieillissement rapide des gouttelettes.Un état de gel stable et non aggloméré est obtenu..Cette situation est très favorable dans le cas du système αS/pLK en raison de sa plus grande affinité et de son réseau d’interactions plus simple entre paires de protéines, qui permet une transition rapide semblable à un gel.Au contraire, les gouttelettes ayant une valence insatisfaisante et, par conséquent, des régions chargées de protéines disponibles pour l'interaction, permettent au coacervat de fusionner et de mouiller plus facilement la surface hydrophile afin de réduire son énergie de surface élevée.Cette situation est préférable pour les coacervats αS/Tau441, qui possèdent un réseau complexe multivalent constitué de faibles interactions Tau-Tau et αS-Tau.À leur tour, les coacervats plus gros conserveront plus facilement leurs propriétés fluides, permettant ainsi à d’autres interactions protéine-protéine de se produire.Finalement, des agrégats amyloïdes hétérogènes contenant à la fois αS et tau se forment dans le liquide coacervat, ce qui peut être lié à ceux trouvés dans les corps d'inclusion, caractéristiques des maladies neurodégénératives.
Les grandes structures fluides formées lors de la maturation de αS/Tau441 avec un environnement protéique très encombré mais dynamique et, dans une moindre mesure, les coacervats αS/ΔNt-Tau sont des réservoirs idéaux pour la nucléation de l'agrégation des protéines.Nous avons en effet observé la formation d'agrégats protéiques solides dans ce type de coacervats protéiques, contenant souvent à la fois de l'αS et de la tau.Nous avons montré que ces hétéroagrégats sont stabilisés par des interactions non électrostatiques, sont capables de se lier aux colorants ThT spécifiques de l'amyloïde de la même manière que les fibrilles amyloïdes typiques et ont en effet une résistance similaire à diverses influences.Il a été démontré que les agrégats αS/tau formés par le LLPS possèdent des propriétés de type amyloïde.En effet, la variante mature de Tau déficiente en agrégation amyloïde est significativement altérée dans la formation de ces agrégats αS hétérogènes au sein du coacervat électrostatique liquide.La formation d’agrégats αS/Tau441 n’a été observée qu’à l’intérieur des coacervats, qui conservaient des propriétés liquides, et jamais si les coacervats/gouttelettes n’atteignaient pas l’état de gel.Dans ce dernier cas, la force accrue des interactions électrostatiques et, par conséquent, la rigidité du réseau protéique empêchent les réarrangements conformationnels nécessaires des protéines pour établir de nouvelles interactions protéiques nécessaires à la nucléation amyloïde.Cependant, cela peut être réalisé avec des coacervats plus flexibles, de type liquide, qui à leur tour sont plus susceptibles de rester liquides à mesure qu'ils augmentent en taille.
Le fait que la formation d’agrégats au sein de la phase condensée soit préférable dans les gros condensats αS/Tau plutôt que dans les petites gouttelettes qui gélifient rapidement, souligne la pertinence d’identifier les facteurs qui contrôlent la coalescence des gouttelettes.Ainsi, non seulement il existe une tendance à la séparation des phases, mais la taille du condensat doit être contrôlée pour un bon fonctionnement ainsi que pour la prévention des maladies58,61.Nos résultats mettent également en évidence l’importance de l’équilibre entre LLPS et LSPT pour le système αS/Tau.Alors que la formation de gouttelettes peut protéger contre l’agrégation amyloïde en réduisant la quantité de monomères protéiques disponibles dans des conditions de saturation, comme cela a été proposé dans d’autres systèmes63,64, la fusion de gouttelettes à des niveaux élevés de gouttelettes peut conduire à une agrégation interne des protéines par le biais de lents réarrangements conformationnels.réseaux de protéines..
Dans l’ensemble, nos données soulignent fortement la pertinence de la valence cohésive et des interactions satisfaites/insatisfaites dans les réseaux de drop dans le contexte du LSPT.En particulier, nous montrons que les condensats αS/Tau441 de pleine longueur sont capables de fusionner et de nucléer efficacement pour former des hétéroagrégats de type amyloïde incluant les deux protéines et proposons un mécanisme moléculaire basé sur nos résultats expérimentaux.La co-agrégation de deux protéines dans le coacervat fluide αS/Tau que nous rapportons ici pourrait en effet être liée à la co-localisation de deux protéines dans des inclusions, caractéristiques de la maladie, et pourrait contribuer à comprendre la relation entre LLPS et agrégation amyloïde, ouvrant la voie à une IDP hautement chargée dans la neurodégénérescence.
Les mutants monomères WT-αS, cystéine (Q24C-αS, N122C-αS) et ΔCt-αS (Δ101-140) ont été exprimés dans E. coli et purifiés comme décrit précédemment.Du DTT 5 mM a été inclus dans toutes les étapes de la purification des mutants de cystéine αS pour empêcher la formation de liaisons disulfure.Les cultures d'E. cultivé jusqu'à OD600 = 0,6-0,7 à 37 °C et 180 tr/min, et l'expression a été induite avec de l'IPTG pendant 3 heures à 37 °C.Récolter les cellules à 11 500 xg pendant 15 min à 4 °C et laver avec un tampon salin contenant 150 mM de NaCl.Remettre en suspension le culot dans du tampon de lyse (20 ml pour 1 L LB : MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptine 100 μM).L'étape de sonication a été réalisée sur glace avec une amplitude de 80% pendant 10 impulsions (1 min allumée, 1 min éteinte).Ne pas dépasser 60 ml en une seule échographie.Les lysats d'E. coli ont été chauffés à 95°C pendant 20 minutes, puis refroidis sur de la glace et centrifugés à 127 000 x g pendant 40 minutes.Le surnageant clarifié a été appliqué sur une membrane de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) et dialysé contre 4 L de tampon de dialyse (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) pendant 10 heures.Une colonne échangeuse de cations de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) a été équilibrée avec un tampon d'équilibrage (MES 20 mM, pH 6, 8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0, 1 mM).Le lysat de tau a été filtré sur un filtre PVDF de 0,22 µm et injecté dans la colonne à un débit de 1 ml/min.L'élution a été réalisée progressivement, la protéine tau a été éluée avec un tampon d'élution à 15–30 % (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et toutes les fractions contenant une bande avec le poids moléculaire attendu de tau ont été concentrées à l'aide d'un filtre centrifuge de 10 kDa et remplacées par un tampon contenant 10 mM de HEPES, pH 7, 4, NaCl 500 mM et DTT 2 mM pour la concentration finale en protéines était de 100 µM.La solution protéique a ensuite été passée à travers un filtre PVDF de 0,22 µm, rapidement congelée et stockée à -80°C.La protéine K18 a été aimablement fournie par le professeur Alberto Boffi.La pureté de la préparation était >95 %, comme l'a confirmé SDS-PAGE et MALDI-TOF/TOF.Diverses cystéines ont été marquées chimiquement avec AlexaFluor488-maléimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ou TEMPOL-maléimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).ont été confirmés par absorbance et MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau et K18 ont été marqués avec des résidus de cystéine native aux positions 191 et 322 en utilisant Atto647N-maléimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Allemagne) en suivant la même procédure.Des cartes de charge nette par résidu pour αS et Tau441 ont été générées à l'aide de CIDER66.
La poly-L-lysine solide (pLK DP 90-110 selon RMN du fournisseur, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) a été dissoute dans 10 mM d'HEPES, 100 mM de NaCl, pH 7,4 à 10 mM de concentration, procédé soniqué pendant 5 minutes. minutes dans un bain-marie à ultrasons et conserver à -20°C.Le PEG-8, le dextrane-70, le FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) et le FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) sont solubles dans l'eau et largement distribués dans le tampon LLPS.La dialyse élimine les sels contaminants.Ils ont ensuite été filtrés sur un filtre seringue ayant une taille de pores de 0, 22 µm et leurs concentrations ont été calculées à l'aide d'un réfractomètre (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Des échantillons de LLPS ont été préparés à température ambiante dans l'ordre suivant : le tampon et l'extrusion ont été mélangés et 1 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM de 2,2,2,2-(Éthane- 1, 2-diyldinitrile) acide tétraacétique (EDTA, carboxynth) et un mélange d'inhibiteur de protéase à 1% (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptine 5 μM).Ensuite, αS et polycations fusionnés (options pLK ou Tau) sont ajoutés.Pour les expériences de séries chronologiques de thioflavine-T (ThT, Carbosynth, Compton, Royaume-Uni), utilisez la concentration totale de ThT comme étant la moitié de la concentration d’αS.Mélangez doucement mais soigneusement les échantillons pour vous assurer qu’ils sont homogènes.La concentration de chaque composant variait d'une expérience à l'autre, comme décrit dans la section Résultats.L'azide a été utilisé à une concentration de 0,02 % (p/v) chaque fois que la durée de l'expérience dépassait 4 heures.Pour toutes les analyses utilisant des échantillons LLPS, laissez le mélange s’équilibrer pendant 5 minutes avant l’analyse.Pour l'analyse de diffusion de la lumière, 150 µl d'échantillons ont été chargés sur des microplaques à 96 puits non contraignantes (µClear®, noir, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Autriche) et recouverts d'un film adhésif.Les LLP ont été surveillées en mesurant l'absorbance à 350 nm au centre de la solution dans un lecteur de plaques CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne).Les expériences ont été réalisées en triple à 25°C et les erreurs ont été calculées en tant qu'écart type par rapport à la moyenne.La phase diluée a été quantifiée par centrifugation d'échantillons et analyse sur gel SDS-PAGE, et la fraction αS dans les phases diluée et concentrée a été quantifiée dans diverses solutions LLPS.Un échantillon de 100 µl de LLPS contenant 1 µM d'αS marqué par AF488 a été préparé par mélange minutieux suivi d'une centrifugation à 9 600 x g pendant 30 minutes, après quoi le précipité était généralement visible.Les 50 µl supérieurs du surnageant ont été utilisés pour la quantification des protéines à l’aide d’un gel SDS-PAGE.Les gels ont été numérisés avec des filtres AF488 à l'aide d'un système d'imagerie sur gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ou colorés avec une coloration de Coomassie et visualisés avec des filtres appropriés.Les bandes résultantes ont été analysées à l'aide d'ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, USA).Les expériences ont été réalisées en double dans deux expériences différentes avec des résultats similaires.
En règle générale, 150 µl d'échantillons ont été appliqués sur des microplaques à 96 puits non liantes et visualisés à température ambiante sur un microscope inversé Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne).Pour les expériences ponctuelles, des plaques µ-Slide Angiogenèse (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Allemagne) ou des microplaques en polystyrène à 96 puits (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ont également été utilisées.Des lampes halogènes EL6000 ou aux halogénures métalliques au mercure ont été utilisées comme sources d'éclairage (pour l'imagerie BF/DIC et WF, respectivement).Pour la microscopie WF, un objectif aérien à grossissement 40x (Leica Microsystems, Allemagne) a été utilisé pour concentrer la lumière sur l'échantillon et le collecter.Pour les échantillons marqués AF488 et ThT, filtrez l'excitation et l'émission avec des ensembles de filtres GFP standard, des filtres passe-bande d'excitation et d'émission, respectivement, des filtres passe-bande de 460 à 500 nm et de 512 à 542 nm, et un miroir dichroïque de 495 nm.Pour les échantillons marqués avec Atto647N, un ensemble standard de filtres Cy5 avec des filtres passe-bande d'excitation et d'émission de 628 à 40 nm et de 692 à 40 nm, respectivement, et un miroir dichroïque de 660 nm ont été utilisés.Pour la microscopie BF et DIC, utilisez le même objectif de collecte de lumière réfléchie.La lumière collectée a été enregistrée sur une caméra CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Allemagne).Le temps d'exposition était de 50 ms pour l'imagerie par microscopie BF et DIC et de 20 à 100 ms pour l'imagerie par microscopie WF.À titre de comparaison, le temps d'exposition pour toutes les expériences avec ThT était de 100 ms.Des expériences accélérées ont été réalisées pour visualiser la coalescence des gouttelettes, des images étant collectées toutes les 100 ms pendant plusieurs minutes.ImageJ (NIH, USA) a été utilisé pour l'analyse d'images.Les expériences ont été réalisées en triple avec des résultats similaires.
Pour les expériences de colocalisation, FRAP et reconstruction 3D, les images ont été acquises sur un microscope confocal inversé Zeiss LSM 880 à l'aide d'une édition bleue ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne).Des échantillons de 50 µl ont été appliqués sur des boîtes de Petri d'angiogenèse µ-Slide (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Allemagne), traités avec un polymère hydrophile (ibiTreat) et montés dans un objectif à immersion dans l'huile 63 × (Huile Plan-Apochromat 63 × / NA 1,4). sur DIC).Les images ont été acquises à l'aide de lignes laser à argon de 458 nm, 488 nm et 633 nm avec une résolution de 0,26 µm/pixel et un temps d'exposition de 8 µs/pixel pour des fenêtres de détection d'excitation et d'émission de 470 à 600 nm, 493 à 628 nm, et 638–755 nm ont été utilisés pour visualiser respectivement ThT, AF488 et Atto647N.Pour les expériences FRAP, la photographie accélérée de chaque échantillon a été enregistrée à 1 image par seconde.Les expériences ont été réalisées en triple à température ambiante avec des résultats similaires.Toutes les images ont été analysées à l'aide du logiciel Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne).Les courbes FRAP ont été normalisées, tracées et ajustées aux données intensité/temps extraites d'images à l'aide de Zen 2 à l'aide d'OriginPro 9.1.Les courbes de récupération ont été ajustées à un modèle mono-exponentiel pour tenir compte de la diffusion moléculaire avec un terme exponentiel supplémentaire pour tenir compte de l'effet de blanchiment de l'acquisition.Nous avons ensuite calculé D en utilisant le rayon de blanchiment nominal et la demi-vie de récupération précédemment déterminée, comme dans l'équation de Kang et al.5 35 illustré.
Des variantes simples de cystéine d'αS ont été synthétisées avec le 4-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-N-oxyl (TEMPOL) aux positions 24 (TEMPOL-24-αS) et 122 (TEMPOL-122-αS), respectivement.Spin Labeling Pour les expériences EPR, la concentration en αS a été fixée à 100 µM et la concentration en PEG était de 15 % (p/v).Pour diverses conditions d'agrégation, le rapport αS:pLK était de 1:10, tandis que les rapports αS:ΔNt-Tau et αS:Tau441 étaient maintenus à 1:1.Pour les expériences de titrage de liaison en l'absence d'encombrement, le TEMPOL-122-αS a été maintenu à 50 µM et les polycations ont été titrés à des concentrations croissantes, en préparant chaque condition séparément.Les mesures CW-EPR ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre en bande X Bruker ELEXSYS E580 équipé d'un résonateur Bruker ER4118 SPT-N1 fonctionnant à une fréquence micro-ondes (SHF) d'environ 9,7 GHz.La température a été fixée à 25°C et contrôlée par un cryostat à azote liquide.Les spectres ont été obtenus dans des conditions non saturées à une puissance MW de 4 mW, une amplitude de modulation de 0,1 mT et une fréquence de modulation de 100 kHz.Les intensités spectrales ont été normalisées pour éviter les différences de concentrations de spin entre les échantillons et une éventuelle réduction de spin due aux concentrations résiduelles d'agents réducteurs dans les échantillons contenant Tau441 ou ΔNt-Tau (présents dans les solutions protéiques d'origine).Les valeurs données de g ont été obtenues grâce à la modélisation spectrale EPR réalisée à l'aide du logiciel Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implémenté dans Matlab®67.Des modèles isotropes à une ou deux composantes ont été utilisés pour modéliser les données.Après avoir normalisé tous les signaux, les résidus ont été calculés en soustrayant chaque simulation du spectre expérimental correspondant.Pour l’analyse du titrage de liaison, l’intensité relative de la troisième bande par rapport à la deuxième bande du spectre EPR normalisé (IIII/III) a été utilisée pour surveiller la liaison des polycations à αS.Pour estimer la constante de dissociation (Kd), la courbe résultante a été ajustée à un modèle approximatif supposant n sites de liaison identiques et indépendants.
Des expériences de spectroscopie RMN ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre RMN Bruker Neo 800 MHz (1H) équipé d'une crysonde et d'un gradient Z.Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant 130 à 207 µM d'αS et les équivalents αS/ΔNt-Tau et pLK correspondants dans 10 mM d'HEPES, 100 mM de NaCl, 10 % d'OD, pH 7,4 et ont été réalisées à 15 °C.Pour surveiller le LPS par RMN, 10 % de PEG ont été ajoutés aux échantillons pré-mélangés.Le tracé des perturbations des déplacements chimiques (Fig. 1b) montre les déplacements chimiques moyens 1H et 15N.Les spectres αS 2D1H-15N HSQC ont été attribués sur la base d'une attribution précédente (entrée BMRB n° 25227) et confirmés par l'enregistrement et l'analyse des spectres 3D de HNCA, HNCO et CBCAcoNH.Les déplacements chimiques 13Cα et 13Cβ ont été calculés en présence de ΔNt-Tau ou pLK pour mesurer les changements possibles dans les tendances de la structure secondaire par rapport aux déplacements chimiques αS dans la conformation de bobine aléatoire pure 68 (Figure 5c supplémentaire).Les taux R1ρ ont été mesurés en enregistrant des expériences hsqctretf3gpsi (obtenues à partir de la bibliothèque Bruker) avec des retards de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 et 800 ms, et les fonctions exponentielles ont été ajustées aux retards d'intensité maximale à différents fois pour déterminer le R1ρ et son incertitude expérimentale.
Des expériences de microscopie à fluorescence bicolore à résolution temporelle ont été réalisées sur un microscope confocal à fluorescence MT200 commercial à résolution temporelle (PicoQuant, Berlin, Allemagne) avec un dispositif de comptage de photons uniques corrélé dans le temps (TCSPC).La tête de diode laser est utilisée pour l'excitation pulsée entrelacée (PIE), le faisceau traverse un guide d'onde monomode et est accordé sur une puissance laser de 10 à 100 nW pour des lignes laser de 481 nm et 637 nm mesurées après un miroir dichroïque.Cela garantit un taux de comptage de photons optimal, évitant les effets de crénelage des photons, de photoblanchiment et de saturation.Des lamelles ou des plaques d'angiogenèse μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Allemagne) ont été placées directement dans de l'eau d'immersion sur une lentille Super Apochromat 60x NA 1.2 avec un collier correcteur (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Un miroir dichroïque de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, Illinois, États-Unis) a été utilisé comme séparateur de faisceau principal.Le rayonnement non focalisé est bloqué par un trou d'un diamètre de 50 microns, puis le rayonnement focalisé est divisé en 2 voies de détection par un séparateur de faisceau 50/50.Des filtres d'émission passe-bande (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 pour le colorant vert (AF488) et 690/70 pour le colorant rouge (Atto647N) ont été utilisés devant le détecteur.Des diodes à avalanche à photon unique (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italie) ont été utilisées comme détecteurs.La collecte et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel SymphoTime64 disponible dans le commerce (PicoQuant GmbH, Berlin, Allemagne).
Cinquante microlitres d'échantillons LLPS ont été appliqués à des puits d'angiogenèse μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Allemagne).Les images résultantes sont focalisées à 20 µm au-dessus du fond du puits pour une distance de travail objective optimale pour les gouttelettes en suspension et à ~1 µm pour les radeaux et les points avec une résolution axiale d’au moins 0,25 µm/pixel et un temps de retard de 400 µs/pixel.Sélectionnez les données en appliquant un seuil d’intensité basé sur l’intensité moyenne du signal de fond (PBG, moyenne + 2σ) pour chaque canal afin que seules les gouttelettes, radeaux ou taches de protéines liquides soient sélectionnées, filtrant toute origine possible de la phase dispersée.Pour analyser la durée de vie de chaque espèce (τ) de chaque canal (vert, « g » pour AF488 et rouge, « r » pour Atto647N), nous avons sélectionné des régions d'intérêt (ROI) contenant des gouttelettes, des radeaux ou des taches (Figure 1 supplémentaire). ).8b) et les avons dérivés en ajustant leur décroissance de durée de vie (τD, τR et τP pour les gouttelettes, les radeaux ou les taches, respectivement, voir la Fig. 8c supplémentaire) dans chaque canal à l'aide d'une analyse d'ajustement de queue et d'un modèle de désintégration à deux composants.Moyenne τ à partir de τ .Les ROI qui produisaient trop peu de photons pour un ajustement multi-exponentiel ont été exclues de l'analyse.Le seuil utilisé était <104 photons pour les radeaux et les points et 103 pour les largages.Les gouttelettes ont un seuil plus bas car il est difficile d'obtenir des courbes de désintégration avec des valeurs d'intensité plus élevées, puisque les gouttelettes dans le champ d'image sont généralement plus petites et moins nombreuses.Les ROI avec un nombre de photons supérieur à la limite d'accumulation de photons (fixée à > 500 comptes/pixel) ont également été écartées pour analyse.Faites correspondre la courbe de décroissance d'intensité obtenue à partir de la région d'intérêt avec une intensité à 90 % du maximum (légèrement après l'intensité maximale de la décroissance) depuis le début de la durée de vie pour garantir une interférence IRF minimale tout en maintenant la même pour toutes les décroissances d'intensité. paramètres Fenêtre de temps relative Ont été analysés 25 à 50 ROI pour les radeaux et les spots et 15 à 25 ROI pour les largages, images sélectionnées parmi plus de 4 répétitions enregistrées à partir d'au moins 3 expériences indépendantes.Des tests t bilatéraux ont été utilisés pour évaluer les différences statistiques entre les espèces ou entre les systèmes de coacervat.Pour une analyse pixel par pixel de la durée de vie (τ), l'atténuation totale de la durée de vie sur le champ pour chaque canal a été calculée et une approximation d'un modèle d'atténuation exponentielle à 2/3 composantes a été réalisée.L'atténuation de la durée de vie de chaque pixel a ensuite été ajustée à l'aide des valeurs τ précédemment calculées, ce qui a donné une image d'ajustement FLIM pseudo-couleur.La plage de durée de vie de l'ajustement de la queue était la même sur toutes les images du même canal, et chaque désintégration produisait suffisamment de photons pour fournir un ajustement fiable.Pour l'analyse FRET, les pixels ont été sélectionnés en appliquant un seuil d'intensité inférieur de 100 photons, ce qui correspond à une moyenne d'un signal de fond (FBG) de 11 photons.L'intensité de fluorescence de chaque canal a été corrigée par des facteurs de correction déterminés expérimentalement : 69 diaphonie spectrale α était de 0,004, excitation directe β était de 0,0305, efficacité de détection γ était de 0,517.L'efficacité FRET au niveau du pixel est ensuite calculée à l'aide de l'équation suivante :
où FDD est l'intensité de fluorescence observée dans le canal donneur (vert), FDA est l'intensité de fluorescence observée dans le canal accepteur (rouge) sous excitation indirecte, et FAA est l'intensité de fluorescence observée dans le canal accepteur (rouge) sous excitation directe ( TARTE).Des impulsions d'intensité de fluorescence sont observées dans le canal).
Placer 100 µl de solutions réactionnelles LLPS contenant 25 µM de Tau441 monomère non marqué (avec ou sans 25 µM d'αS) dans un tampon LLPS (complété comme ci-dessus) sur des microplaques non liantes à 96 puits recouvertes d'une feuille adhésive et la formation de gouttelettes a été vérifiée par microscopie WF après équilibration.dans les 10 minutes.Après 48 heures d'incubation à température ambiante, la présence de radeaux et de taches protéiques a été confirmée.Retirez ensuite soigneusement le liquide sur les radeaux des puits, puis ajoutez 50 L de tampon de dissociation (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) et incubez pendant 10 min.La concentration élevée en sel garantit que le LLPS ne se répétera pas en raison du PEG résiduel et que les éventuels assemblages de protéines formés uniquement par des interactions électrostatiques seront désassemblés.Le fond du puits a ensuite été soigneusement gratté avec la pointe d’une micropipette et la solution obtenue a été transférée dans un puits d’observation vide.Après incubation des échantillons avec 50 µM ThT pendant 1 h, la présence de taches isolées a été vérifiée par microscopie WF.Préparer les fibrilles αS soniquées en incubant 300 µl d’une solution αS de 70 µM dans du PBS avec pH 7,4, azoture de sodium 0,01 % à 37 °C et 200 tr/min sur un agitateur orbital pendant 7 jours.La solution a ensuite été centrifugée à 9 600 x g pendant 30 min, le culot a été remis en suspension dans du PBS pH 7,4 et soniqué (1 min, cycle de 50 %, amplitude de 80 % dans un sonicateur Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) des échantillons de fibrilles. avec une distribution de taille relativement uniforme des petites fibrilles.
L'analyse FCS / FCCS et la détection de coïncidence bicolore (TCCD) ont été réalisées sur le même microscope confocal fluorescent à résolution temporelle MT200 (Pico-Quant, Berlin, Allemagne) utilisé pour les expériences de microscopie FLIM-FRET utilisant le mode PIE.La puissance laser pour ces expériences a été ajoutée à 6,0 µW (481 nm) et 6,2 µW (637 nm).La combinaison de ces puissances laser a été choisie pour produire une luminosité similaire pour les paires de fluorophores utilisées tout en atteignant des taux de comptage optimaux et en évitant le photoblanchiment et la saturation.La collecte et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel SymphoTime64 version 2.3 disponible dans le commerce (PicoQuant, Berlin, Allemagne).
Les échantillons d'agrégats αS/Tau isolés obtenus à l'aide du LLPS sont dilués dans un tampon d'isolement à la concentration monomoléculaire appropriée (généralement une dilution au 1/500, car les agrégats sont déjà à de faibles concentrations lorsqu'ils sont isolés à partir d'échantillons de coacervat).Les échantillons ont été appliqués directement sur des lamelles (Corning, USA) préalablement recouvertes d'une solution de BSA à une concentration de 1 mg/mL.
Pour l'analyse PIE-smFRET dans les canaux vert et rouge, un seuil d'intensité inférieur de 25 photons a été appliqué pour filtrer les signaux de faible intensité provoqués par des événements monomères (à noter que les monomères sont plus nombreux que les échantillons agrégés par rapport aux agrégats isolés).Ce seuil a été calculé comme étant égal à cinq fois l'intensité moyenne de l'αS monomère obtenue à partir de l'analyse d'échantillons de monomères purs afin de sélectionner spécifiquement les agrégats à analyser.Le circuit de commande PIE, associé à l'acquisition de données TSCPC, a permis l'application d'un filtre de pondération à vie qui aide à éliminer la diaphonie de fond et spectrale.L'intensité des éruptions cutanées sélectionnée à l'aide des seuils ci-dessus a été corrigée à l'aide du signal de fond moyen déterminé à partir des histogrammes d'occurrence par rapport à l'intensité/bac des échantillons tampons uniquement.Les salves associées aux gros agrégats occupent généralement plusieurs intervalles consécutifs dans la trace temporelle (fixée à 1 ms).Dans ces cas-là, un bac de résistance maximale a été choisi.Pour l’analyse FRET et stœchiométrique, le facteur gamma γ théoriquement déterminé (0,517) a été utilisé.La diaphonie spectrale et les contributions à l'excitation directe sont négligeables (déterminées expérimentalement) à la puissance laser d'excitation utilisée.L'efficacité et la stœchiométrie du FRET lors d'une explosion sont calculées comme suit.