Composant chimique de tube enroulé en acier inoxydable 347, identification de nouvelles protéines chaperons de l'antigène leucocytaire humain-A (HLA-A) sensibles à l'interféron à l'aide de la spectrométrie de masse réticulée (CLMS)

Merci d'avoir visité Nature.com.Vous utilisez une version de navigateur avec une prise en charge CSS limitée.Pour une expérience optimale, nous vous recommandons d'utiliser un navigateur mis à jour (ou de désactiver le mode de compatibilité dans Internet Explorer).De plus, pour garantir un support continu, nous affichons le site sans styles ni JavaScript.
Curseurs affichant trois articles par diapositive.Utilisez les boutons Précédent et Suivant pour vous déplacer dans les diapositives, ou les boutons du contrôleur de diapositives à la fin pour vous déplacer dans chaque diapositive.

Description du produit

Tubes de bobine en acier inoxydable 347L, qualité d'acier : SS347L

Le système de signalisation de l'interféron induit une forte réponse cytokinique à un large éventail de signaux pathologiques et pathologiques intrinsèques provenant de l'environnement, entraînant l'induction de sous-ensembles de protéines inductibles par l'interféron.Nous avons appliqué la spectrométrie de masse à liaison croisée (CLMS) médiée par le DSS pour détecter de nouvelles interactions protéine-protéine dans le domaine des protéines induites par l'interféron.En plus des protéines attendues inductibles par l'interféron, nous avons également identifié de nouveaux adduits réticulés intermoléculaires et intramoléculaires de protéines canoniques inductibles par l'interféron telles que MX1, USP18, OAS3 et STAT1.Nous nous sommes concentrés sur la validation orthogonale d'un nouvel ensemble de réseaux protéiques inductibles par l'interféron formés par les protéines HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) par co-immunoprécipitation et sur leur étude plus approfondie à l'aide de la modélisation de la dynamique moléculaire.La modélisation de la dynamique conformationnelle du complexe protéique a révélé plusieurs sites d'interaction qui reflétaient les interactions identifiées dans les résultats du CLMS.Ensemble, nous présentons une étude pilote du CLMS pour identifier de nouveaux complexes de signalisation induits par l'interféron, et attendons avec impatience une utilisation plus large du CLMS pour identifier une nouvelle dynamique des interactions protéiques dans le microenvironnement tumoral.
Avant qu'une réponse immunitaire adaptative ne commence, le système de défense inné de l'hôte déclenche une réponse antimicrobienne médiée par une famille de cytokines alpha-hélicoïdales sécrétées appelées interférons (IFN).Les classes d'IFN de type I, IFNα et IFNβ, activent les réponses cellulaires, notamment les états antiviraux, pro-apoptotiques, proinflammatoires et antiprolifératifs.Chez l’homme, 13 sous-types d’IFNα sont connus, tous regroupés sur le chromosome 91. Étonnamment, seul l’IFNα2 a été étudié pour une utilisation clinique.Récemment, une attention particulière a été accordée à la recherche sur d’autres sous-types d’IFNα.Une étude récente a montré que l’IFNα14 est l’une des isoformes les plus efficaces pour restreindre la réplication du VHB2 et du VIH-13,4 par rapport au sous-type canonique IFNα2.
Il a été établi que les complexes de récepteurs d'interféron de type I activés (IFNAR1 et IFNAR2) déclenchent une cascade de transduction de signal médiée par les Janus kinases TYK2 et JAK15,6.Ces Janus kinases phosphorylent des transducteurs de signal et des activateurs de protéines transcriptionnelles (STAT1 et STAT2) sur les résidus tyrosine pour initier l'hétérodimérisation médiée par le domaine SH26.Par la suite, IRF9 se lie aux hétérodimères STAT pour former un complexe trimérique du gène du facteur 3 stimulé par l'IFN (ISGF3), qui se déplace vers le noyau et induit la transcription de plus de 2 000 gènes stimulés par l'interféron (ISG)5,6,7,8.
Les ISG constituent l’épine dorsale du système immunitaire inné, notamment en réponse à une attaque virale.En tant que première ligne de défense contre les infections virales, les cellules déploient rapidement des interactions étendues de protéines cellulaires avec un large éventail d’activités biologiques.Ces protéines comprennent des récepteurs de reconnaissance de formes, des molécules de signalisation, des facteurs de transcription et des protéines ayant des fonctions antivirales directes, ainsi que des régulateurs négatifs des réponses immunitaires9.Une grande partie des informations sur l’activité des ISG proviennent d’écrans fonctionnels utilisant des écrans de surexpression10,11 ou des techniques de silençage génétique (siRNA, RNAi et CRISPR)12,13 dans lesquelles des ISG individuels sont exprimés ou inhibés et leur activité est testée sur divers virus.Bien que ces études aient déterminé les propriétés antivirales de chaque ISG, les mécanismes moléculaires sous-jacents de chaque ISG restent largement inconnus.Il est généralement admis que de nombreuses protéines interagissent avec une ou plusieurs cytokines pour assurer leur pleine activité. Ainsi, soit les ISG interagissent directement, soit leurs interactions sont médiées par des protéines cellulaires.Par exemple, une récente étude protéomique photoréticulée a identifié l'ATPase VCP/p97 comme un partenaire d'interaction majeur de l'IFITM3, dont l'inhibition entraîne des défauts dans le tri lysosomal, le renouvellement et le cotransport de l'IFITM3 avec les particules virales 14 .En utilisant l'immunoprécipitation, nous avons identifié VAPA, une protéine associée aux vésicules, comme partenaire d'interaction avec IFITM1/2/3 qui médie la maturation virale médiée par le cholestérol, ce qui a été confirmé par une autre étude utilisant un système à deux hybrides de levure.Soutien scientifique 15 , 16 .
Un processus biologique fondamental impliqué dans la suppression de l'infection et de la transformation maligne est la présentation de l'antigène, qui est médiée par des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH).Les peptides (8 à 12 acides aminés de long) provenant de protéines clivées, prématurément terminées ou mal repliées sont chargés dans l'hétérodimère du CMH-I (constitué de chaînes lourdes et légères du CMH-I, appelées β-2-microglobuline ; β2M) 17,18.Les trimères CMH-I stables résultants sont transportés vers la surface cellulaire, où ils présentent des peptides intracellulaires aux cellules T CD8+ (cellules T cytotoxiques)17.Les lymphocytes T reconnaissent et détruisent ces agents pathogènes et les cellules porteuses d'un antigène spécifique de la tumeur.Par conséquent, les agents pathogènes et les cellules tumorales suppriment souvent le processus de présentation des antigènes pour éviter la surveillance immunitaire.De plus, le CMH-I est régulé négativement dans 40 à 90 % des tumeurs humaines et est souvent associé à un pronostic plus sombre19.
Les gènes impliqués dans la réponse aux agents pathogènes doivent rapidement basculer entre un état de repos et un état de transcription active.Par conséquent, on suppose que plusieurs protéines cellulaires sont impliquées dans la réponse à une demande élevée d'IFN sur de courtes périodes de temps, y compris le remodelage et la modification de la chromatine promotrice 20,21.La plupart des études se sont concentrées sur l'identification de partenaires protéiques ISG individuels en présence d'IFN.Plusieurs études protéomiques et transcriptomiques sur des systèmes cellulaires modèles ont élucidé l'effet de l'IFN sur le paysage cellulaire.Cependant, malgré une compréhension croissante de la dynamique induite par les interférons, nous savons encore peu de choses sur l’implication des ISG.Lorsque l’on considère la complexité et la dynamique temporelle de la signalisation de l’interféron, deux questions se posent : (i) est-il possible de stabiliser et de piéger les complexes multiprotéiques impliqués dans la signalisation rapide, et (ii) ces interactions peuvent-elles être cartographiées dans l’espace 3D ?
Pour résoudre ces problèmes, nous avons mis en œuvre une réticulation chimique (DSS) médiée par le disuccinimide couplée à une spectrométrie de masse (CLMS) pour étudier le réseau d'interactions protéiques induit par l'IFNα et sa dynamique.Le DSS ajoute des liaisons covalentes entre les résidus proximaux de protéines et/ou de complexes protéiques in vivo.L'analyse MS ultérieure révèle des sites de réticulation spécifiques qui reflètent la proximité spatiale de régions au sein d'une protéine particulière, appelées liaisons internes, ou de sous-unités dans des complexes protéiques, appelées interrelations.Grâce à cette approche, nous avons identifié plusieurs nouveaux complexes protéine-protéine ainsi que des réseaux d'interactions multiprotéiques induits par l'interféron.En testant davantage un sous-ensemble de ces nouvelles interactions, nous démontrons que H2BFS (FS de type histone H2B ; ci-après dénommé H2B) et MDN1 agissent comme partenaires de liaison pour HLA-A.
Les cellules Flo-1 sont l’un des modèles in vitro les plus connus d’adénocarcinome de l’œsophage, car elles imitent les principales caractéristiques des tumeurs de l’œsophage22,23.Cependant, toutes les tumeurs ne sont pas immunogènes et pour déterminer si les cellules Flo-1 répondent au traitement par interféron, nous avons traité les cellules Flo-1 avec 10 ng/ml d'IFNα pendant 72 heures.Les cellules Flo-1 ont montré une induction précoce de pSTAT1 et d'IRF1, commençant 2 heures après le traitement et se poursuivant pendant 72 heures, avec une diminution dépendante du temps des niveaux stationnaires d'IRF1 (Figure 1A).Les ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 et ISG15) se sont révélés fortement induits après 6 heures, imitant les réponses classiques de phase intermédiaire et tardive à l'IFNα (Figure 1A).Ensemble, ces données suggèrent que ce modèle cellulaire peut être utilisé pour étudier les réponses à l'interféron.
Réponses différentielles d’expression des protéines dans les cellules Flo-1 après traitement à l’IFNα.(A) L’expression des protéines dans les cellules Flo-1 traitées avec 10 ng/ml d’IFNα pendant 2, 6, 24, 48 et 72 heures a été analysée par immunoblot en utilisant les anticorps ISG indiqués.(B) Gels SDS-PAGE colorés au bleu de Coomassie d’extraits de cellules entières après réticulation avec DSS pour les durées et les concentrations indiquées.(C) Immunoblot représentatif examiné avec l’anticorps p53(DO-1) provenant des mêmes échantillons pour évaluer le degré de réticulation des protéines.
Pour capturer le paysage des interactions protéiques in situ, nous avons utilisé le DSS, un agent de réticulation largement utilisé en raison de sa perméabilité membranaire élevée et de son temps de réaction relativement court.Le temps de réaction plus court aide à empêcher la formation de grands agrégats de protéines réticulées, maintenant ainsi la stabilité de l'agent de réticulation.Pour déterminer la concentration optimale de DSS et éviter une réticulation excessive, nous avons d'abord exposé les cellules à 5, 2,5 et 1 mM de DSS pendant 5, 10, 5 et 30 minutes, respectivement, et analysé les lysats par SDS-PAGE colorée au Coomassie. (données non présentées) .Les lysats cellulaires semblent être fortement réticulés à la concentration la plus faible et au moment le plus court.Par conséquent, le DSS a été titré à 1, 0,5 et 0,1 mM sur 5 minutes (Figure 1B).Une réticulation optimale a été observée avec du DSS 0, 5 mM pendant 5 minutes, et ces conditions ont été choisies pour les cellules traitées avec IFNα.De plus, la figure 1C montre un Western blot réalisé à l’aide de l’anticorps p53 (DO-1) pour évaluer le degré de réticulation des protéines.
Les cellules Flo-1 ont été traitées avec 10 ng/ml d'IFNα pendant 24 heures avant d'ajouter l'agent de réticulation.Les cellules réticulées ont ensuite été lysées par protéolyse en deux étapes et les protéines ont été traitées par FASP (Fig. 2) 24,25.Les peptides tryptiques réticulés ont été analysés par spectrométrie de masse (Fig. 2).Les spectres MS/MS sont ensuite adaptés à la séquence protéique et quantifiés avec MaxQuant26,27.Les peptides réticulés ont été identifiés à partir des spectres obtenus à l'aide du programme SIM-XL, et les composés individuels ont été combinés dans un réseau complexe à l'aide des pipelines de logiciels informatiques open source xQuest28 et SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifie les interactions protéine-protéine, les chaînes internes et les chaînes individuelles dans des mélanges de protéines simples ou complexes et fournit des scripts pour visualiser les interactions dans les structures protéiques.De plus, il classe chaque référence croisée comme score d'identification en fonction de la qualité du spectre MS/MS29.Plusieurs interactions et complexes protéine-protéine hautement fiables ont été identifiés, et un nouvel ensemble d'interactions a été étudié plus en détail en utilisant la co-immunoprécipitation et les changements conformationnels de complexes à l'aide de la modélisation de la dynamique moléculaire (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Présentation schématique de la méthode CLMS.Les cellules Flo-1 ont été traitées avec 10 ng/ml d'IFNα pendant 24 heures, suivies d'une réticulation protéique in situ à l'aide de DSS, suivie d'une lyse cellulaire et d'une trypsinisation.Les échantillons réticulés ont été analysés à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap et ensuite échantillonnés pour la fragmentation des précurseurs peptidiques au cours de la LC-MS/MS.Deux peptides liés ont été identifiés à partir des spectres obtenus à l’aide du programme SIM-XL (Spectre Recognition Machine of the Crosslinked Peptides), et tous les composés ont été combinés dans un réseau complexe à l’aide de pipelines informatiques.Filtrez les interactions de faible confiance en fonction des scores de taux de faux positifs (FDR).Plusieurs nouvelles interactions protéine-protéine de haute fidélité ont été confirmées par co-immunoprécipitation, et les changements conformationnels dans les complexes ont été examinés à l'aide de la modélisation de la dynamique moléculaire (MD).
Un total d'environ 30 500 et environ 28 500 peptides ont été détectés à l'aide de MaxQuant dans des échantillons d'IFNα non stimulés et stimulés, respectivement (Tableau supplémentaire S1, Fig. 3A).La distribution de la longueur des peptides dans les deux cas montrait une proportion plus élevée de peptides plus gros, indiquant la présence de peptides réticulés (Fig. 3B, C).De plus, une plus grande proportion de peptides plus gros étaient présents dans la plage 40 à 55 dans les échantillons traités à l'IFNα (Fig. 3C).La cartographie des protéines par rapport à l'intensité log2 a montré que les protéines classiques stimulées par l'interféron étaient les plus abondantes par rapport aux échantillons non traités, notamment MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 et HLA-F (Figure 3D).L'analyse des voies pour les protéines enrichies plus de trois fois en réponse au traitement par l'IFNα à l'aide de la base de données des voies Reactome a montré que la présentation et le traitement de l'antigène médié par le CMH-I étaient la voie la plus dominante (Figure 3E).Conformément aux rapports antérieurs, les réponses antivirales médiées par l'OAS et l'ISG15 ainsi que la signalisation IFNα/β et les cytokines faisaient partie des voies activées.De plus, des liaisons croisées entre protéines spécifiques à la lysine et à la sérine ont été identifiées à partir des spectres MS/MS initialement acquis à l'aide de SIM-XL.Une étude récente a rapporté 104 ISG couvrant 20 virus appartenant à 9 classes de virus par méta-analyse d’études individuelles de surexpression d’ISG dans 5 types de cellules9.Cependant, pour surmonter les limitations informatiques liées au criblage de grands ensembles de données, nous avons commencé avec un ensemble de données plus petit pour explorer les interactions possibles entre la liste de gènes IRDS rapportée par Padaria et al., dont la plupart sont des ISG.
Identification de protéines réticulées différentiellement exprimées en réponse à l'IFNα (données obtenues de MaxQuant).(A) Diagramme de Venn représentant le nombre de peptides communs et exclusifs identifiés dans les échantillons Flo-1 traités et non traités par IFNα14.Répartition de la longueur des peptides des échantillons réticulés non traités (B) et traités par IFNα (C).(D) Carte thermique représentant log2 (intensité LFQ) entre les cellules Flo-1 non traitées et traitées par IFNα14.Le panneau de gauche montre les protéines les plus activement activées en présence d’IFNα.(E) Histogramme représentant les 20 principales voies d’enrichissement après traitement par IFNα.La base de données de la voie Reactome a analysé plus de quatre fois les changements dans les protéines sensibles à l'IFNα régulées positivement.
La stimulation par l'ISG médiée par l'interféron est bien documentée, mais au niveau moléculaire, on comprend mal comment ces protéines culminent dans un large éventail de fonctions biologiques.Nous avons étudié les interactions protéiques avec un degré élevé de confiance entre les ISG connus.Fait intéressant, nous avons identifié un réseau comprenant les protéines MX1, USP18, ROBO1, OAS3 et STAT1 qui forment un vaste complexe en réponse au traitement par IFNα (Figure 4, Tableau S2) 32,33,34.Plus important encore, ces interactions ont été trouvées dans tous les triples traités avec l'IFNα et n'ont pas été trouvées dans les échantillons non traités, ce qui suggère qu'elles se sont formées spécifiquement en réponse au traitement par l'IFNα.On sait que STAT1 régule transcriptionnellement l’expression de ces ISG, mais son interaction avec les ISG au niveau protéique n’a pas été étudiée.La structure cristalline de STAT1 a montré que son domaine hélicoïdal (CCD) n'est pas impliqué dans l'interaction avec l'ADN ou les protomères lors de la formation des dimères35.Ces hélices α forment une structure en hélice hélicoïdale qui fournit une surface principalement hydrophile pour que les interactions se produisent 35 .Dans nos données CLMS, nous avons observé que la plupart des interactions avec STAT1 se produisaient dans le domaine SH2 précédant le CCD, le domaine de liaison ou la queue C-terminale (résidus 700 à 708) (Figure 4A).Une étude précédente a rapporté que l'USP18 se lie au CCD et au domaine de liaison à l'ADN (DBD) de STAT2 et est recruté dans la sous-unité du récepteur d'interféron de type I IFNAR2 pour médier l'inhibition de la signalisation de l'interféron de type I 24 .Nos données ont également montré que le domaine catalytique USP18 interagit avec STAT1 DBD (Figure 4A, D), ce qui suggère que STAT1 et STAT2 pourraient jouer un rôle pour attirer l'USP18 vers IFNAR2.
Réseau ISG protéine-protéine identifié dans des cellules réticulées traitées à l'IFNα.(A) Graphique d'interaction 2D montrant les interactions protéine-protéine (générées dans le programme SIM-XL), avec des lignes représentant les interactions intermoléculaires (seuil de réticulation fixé à 3,5).Les domaines d'identités différentes sont marqués par leur couleur32 : domaine MX1, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547) et GED (569-660).Domaines OAS3 : OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) et OAS1_C (903-108).Domaine ROBO1, Ig_3 (67-151), I-set (170-258), I-set (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678-758) et fn3 (777-864).Champs STAT1 : STAT_int (2 à 120), STAT_alpha (143 à 309), STAT_bind (321 à 458), SH2 (573 à 657) et STAT1_TAZ2bind (715 à 739).(B) Visionneuse circulaire de protéines réticulées (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 et STAT1) avec des interactions et des interactions étiquetées en bleu et rouge, respectivement.Le seuil de réticulation a été fixé à 3,5.Les tracés de points indiquent les sites d'interaction STAT1 avec MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) et OAS3 (F), ainsi que les sites d'interaction K ou S entre les deux peptides.Dans la figure, le seuil du score de réticulation est fixé à 3,0.(G) Divers sites d'interaction entre les domaines DI STAT1 et OAS3 superposés à leurs structures protéiques dans PyMol (système graphique moléculaire PyMOL, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (identifiant pdb : 1bf533) et OAS3 (identifiant pdb : 4s3n34).) programme.
Deux isoformes de l'USP18 ont été décrites chez l'homme, une protéine complète située principalement dans le noyau et une isoforme sans domaine N-terminal, USP18-sf, uniformément répartie dans le cytoplasme et le noyau 36 .De plus, il était prévu que l’extrémité N-terminale ne serait pas structurée et ne nécessiterait pas d’activité isopeptidase ni de liaison à ISG1537.La plupart des interactions identifiées dans notre étude étaient situées à l'extrémité N-terminale de la protéine, ce qui suggère que ces interactions impliquent USP18 complet (Figure 4A, D) et se produisent donc probablement dans le noyau.De plus, nos données indiquent également que l’extrémité N-terminale est spécialisée dans les interactions protéine-protéine.Le site de liaison IFNAR2 est situé entre les résidus 312 à 368 et, notamment, aucune des protéines du complexe ne se lie à cette région (Fig. 4A) 37,38.Ces données prises ensemble indiquent que le domaine de liaison IFNAR2 est exclusivement utilisé par la protéine réceptrice.De plus, seuls OAS3 et ROBO1 se sont avérés associés à des domaines en amont de l'extrémité N-terminale et du site de liaison IFNAR2 (Figure 4A).
ROBO1 appartient à la superfamille des immunoglobulines (Ig) des molécules de signalisation transmembranaire et se compose de cinq domaines Ig et de trois domaines fibronectine (Fn) dans la région extracellulaire.Ces domaines extracellulaires sont suivis d'une région membranaire proximale et d'une seule hélice transmembranaire 39. Une région intracellulaire non structurée est située à l'extrémité C-terminale et contient des motifs de séquence conservés qui assurent la médiation de la liaison aux protéines effectrices 39.La région s’étendant des acides aminés ~1 100 à 1 600 est principalement désordonnée.Nous avons constaté que MX1 interagit avec ROBO1 via les domaines Ig, Fn et intracellulaires, tandis que la plupart des interactions avec STAT1 se produisent entre son CCD, son domaine de liaison et l'extrémité C-terminale de ROBO1 (Fig. 4A, E).D'autre part, les interactions avec les régions de liaison DI, DIII et OAS3 étaient réparties dans toute la protéine ROBO1 (Fig. 4A).
La famille des protéines oligoadénylate synthase (OAS) accepte et se lie à l'ARN double brin (ARNdb) intracellulaire, subit des changements de conformation et synthétise des oligoadénylates liés en 2', 5' (2-5 As) 40.Il a été constaté que parmi les trois OAS, OAS3 présente la plus grande affinité pour l'ARNdb et synthétise la plus petite quantité de 2 à 5 As, ce qui peut activer la RNase L et ainsi limiter la réplication virale 41 .La famille OAS est constituée de domaines de nucléotide transférase de type polymérase bêta (pol-β).Des recherches antérieures ont montré que l'activité catalytique du domaine C-terminal (DIII) dépend du domaine de liaison à l'ARNdb (DI), requis pour l'activation d'OAS342.Nous avons observé que les domaines DI et DII d'OAS3 interagissent avec CCD et une petite région de jonction entre SH2 et STAT1 TAD (Figure 4A, F).La superposition de différents sites de réticulation sur la structure protéique a révélé une interaction entre la feuille β et la boucle DBD STAT1 et une poche ou cavité ouverte formée par les résidus 60 à 75 dans le domaine DI d'OAS3 (Fig. 4G).L'orientation des protéines dans le complexe a également indiqué qu'aucune des interactions avec OAS3 n'interférait avec la capacité de liaison à l'ADN de son domaine DI (Fig. S1A).De plus, le domaine N-terminal de la GTPase MX1 interagit largement avec les domaines DI et DIII de l'OAS3 (Fig. 4A).Nous avons également observé une interaction entre OAS1 et MX1 dans les trois répétitions traitées par IFNα, où un seul domaine OAS1 (également catalytiquement actif) a interagi avec les trois domaines MX1 (Figure S2A, B).
Les protéines MX font partie d'une grande famille de GTPases de type dynéine qui contiennent un domaine GTPase N-terminal qui lie et hydrolyse le GTP, un domaine intermédiaire qui assure l'auto-assemblage et une fermeture éclair de leucine C-terminale qui agit comme une GTPase (LZ ).domaine effecteur de domaine25,43.MX1 se lie aux sous-unités des polymérases virales pour bloquer la transcription du gène viral43.Un criblage à deux hybrides de levure précédemment rapporté a montré que le MX1 associé à PIAS1 inhibe l'activation du gène médiée par STAT1 en bloquant l'activité de liaison à l'ADN et qu'il possède également une activité ligase SUMO E344,45.Ici, nous démontrons que MX1 se lie à STAT1 (Figure 4C, D), mais la façon dont cette interaction affecte l'activation du gène médiée par STAT1 en réponse à l'IFNα nécessite une étude plus approfondie.De plus, nous avons également constaté que MX1 interagissait avec IFIT3 et DDX60 dans les trois répétitions traitées par IFNα (Fig. S2C).
DDX60 est une hélicase cytoplasmique induite par l’IFN qui aurait déjà joué un rôle dans la dégradation de l’ARN viral indépendante de RIG-I46.Il interagit avec RIG-I et active sa signalisation d'une manière spécifique au ligand 46. DDX60 se compose d'un domaine hélicase DEXD/H-Box et d'un domaine hélicase C-terminal qui se lient à l'ARN et à l'ADN viraux47.La plupart de ses interactions avec MX1 et IFIT3 se produisent dans de longues régions N- et C-terminales sans domaines ni motifs canoniques (Fig. S2E, F).Cependant, MX1 est également associé au domaine hélicase DEXD/H-Box (Fig. S2E).Les protéines de la famille IFIT possèdent des copies en tandem d'un motif distinctif d'hélice-tour-hélice appelé répétition tétrapeptide (TPR).IFIT3 s'est avéré être un modulateur positif de la signalisation RIG-I et donc un composant du complexe MAVS.Prises ensemble, nos données suggèrent que IFIT3 et DDX60 interagissent principalement dans la région située entre TPR 3 et 6 de IFIT3 et pourraient jouer un rôle dans la signalisation RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Étant donné que le criblage de l’ensemble du protéome nécessite beaucoup de calculs, nous avons ensuite examiné l’intégralité de la base de données UniProt humaine pour détecter la présence de l’une des répétitions traitées par IFNα.Dans cette réplique, nous avons trouvé plusieurs réseaux d’interaction hautement fiables pour HLA-A.L'analyse des voies protéiques identifiées par les spectres MS/MS a montré que le traitement et la présentation des antigènes basés sur le CMH-I sont la principale voie induite par l'interféron (Fig. 3D).Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur l’étude des interactions protéiques des molécules du CMH-I avec un degré élevé de confiance dans tous les échantillons réticulés.HLA est constitué de domaines et de chaînes légères α1, α2 et α3, et la microglobuline β2 (β2m) est une protéine chaperonne constante49.Une fois assemblé dans le réticulum endoplasmique, HLA est instable en l’absence de ligands peptidiques50.Le sillon de liaison aux peptides est formé par les domaines α1 et α2 hautement polymorphes et non structurés sous forme non peptidique et par le domaine α351 relativement moins polymorphe.En présence d'IFNα, nous avons détecté deux complexes HLA-A : l'un interagit avec HMGA1 et H2B (Figure 5, Tableau S3) et l'autre interagit avec MDN1, LRCH4 et H2B (Figure 6).
IFNα induit un réseau d'interaction HLA-A avec H2B (H2BFS) et HMGA1.(A) Terrain 2D (généré dans le logiciel SIM-XL) illustrant différents types d’interactions dans le complexe H2B-HLA-A-HMGA1 : interlien (bleu), interlien (rouge) et lien unique (noir)..Les domaines d'identités différentes sont codés par couleur32 : H2B (histone ; 2-102) et MHC-I (MHC_1 ; 25-203, groupe C1 ; 210-290 et MHC_I_C ; 337-364).Le seuil de réticulation a été fixé à 3,5.Les tracés de points indiquent les sites d'interaction HLA-A avec H2B (B) et HMGA1 (C), ainsi que les sites d'interaction K ou S entre les deux peptides.Dans la figure, le seuil du score de réticulation est fixé à 3,0.(D) Relations entre les protéines présentées dans les structures des protéines H2B, HLA-A et HMGA1 dans le programme PyMOL.Ces structures ont été modélisées à l'aide du serveur Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) et les structures modèles pour les protéines H2B, HLA-A et HMGA1 étaient respectivement 1kx552, 1kj349 et 2eze55.
IFNα induit un réseau d'interaction HLA-A avec H2B (H2BFS), MDN1 et LRCH4.(A) Liens réticulés intramoléculaires (rouges) et intermoléculaires (bleus) présentés sur une carte interactive 2D (générée dans le logiciel SIM-XL) avec MDN1 représenté sous forme de cercle.Le seuil de réticulation a été fixé à 3,5.Les domaines d'identités différentes sont codés par couleur32 : H2B (histone ; 2–102), MHC-I (MHC_1 ; 25–203, groupe C1 ; 210–290 et MHC_I_C ; 337–364) et LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) et CH (535-641)).(B) Relations entre les protéines présentées dans les structures des protéines H2B, HLA-A, LRCH4 et MDN1 dans le programme PyMOL.Ces structures ont été modélisées à l'aide du serveur Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) avec les structures modèles 1kx552, 1kj349, 6hlu62 et 6i2665 pour les protéines H2B, HLA-A, LRCH4 et MDN1, respectivement.Parcelles de points montrant les sites d'interaction K ou S pour HLA-A avec H2B (C), LRCH4 (D) et MDN1 (E).Pour les parcelles, le seuil de score de réticulation a été fixé à 3,0.
En plus de maintenir l’intégrité du génome, l’histone H2B est également impliquée dans la régulation de la transcription.La protéine H2B est constituée d'un domaine histone central (HFD) formé de trois hélices α séparées par des boucles et d'une queue C-terminale 41,52.La majeure partie de l'interaction avec H2B se produit dans l'hélice α1, qui assure la trimérisation avec l'hétérodimère HFD (Fig. 5A, B).Bien que les lysines soient impliquées dans la liaison à l’ADN, certaines lysines sont également des sites alternatifs d’acétylation ou de méthylation.Par exemple, les résidus K43, K46 et K57 de H2B ne sont pas impliqués dans la liaison directe à l'ADN, mais sont la cible de diverses modifications post-transcriptionnelles53.De même, les résidus K44, K47 et K57 dans H2B peuvent jouer un rôle alternatif en présence d'IFNα, notamment en interaction avec d'autres protéines (Fig. 5A, B).De plus, l’histone extrachromosomique H2B active la réponse immunitaire dans divers types de cellules, agissant comme un capteur cytosolique pour détecter les fragments d’ADN double brin (ADNdb) dérivés d’agents infectieux ou de cellules endommagées54.En présence de virus à ADN, la déplétion en H2B a inhibé la production d'IFN-β et la phosphorylation de STAT154.H2B est également connu pour entrer et sortir du noyau plus rapidement que les autres histones centrales54.Des interactions H2B avec MDN1 et LRCH4 ont également été observées dans des échantillons sélectionnés non traités.Nous avons constaté que HLA-A interagissait avec H2B dans les trois échantillons traités par IFNα et dans un échantillon répété non traité.Ces données reflètent le rôle de H2B dans une fonction physiologique alternative indépendante de la régulation transcriptionnelle.
HMGA1 (groupe à haute mobilité AT-Hook 1), une petite nucléoprotéine riche en acides aminés favorisant la maladie, a été identifiée en association avec HLA-A.Il possède une queue C-terminale acide et trois DBD distincts appelés crochets AT car ils se lient au petit sillon de la région riche en AT dans l'ADNdb55,56.Cette liaison provoque la courbure ou le redressement de l’ADN, permettant aux facteurs de transcription canoniques d’accéder à sa séquence consensus.On pense que la queue C-terminale est impliquée dans les interactions protéine-protéine et dans le recrutement de facteurs de transcription, puisque les mutants par délétion C-terminale sont incapables d'initier la transcription57.De plus, ce domaine contient plusieurs sites de phosphorylation conservés qui sont des substrats connus pour les kinases 58.Nous avons observé des interactions HLA-A et H2B avec HMGA1 en dehors du domaine C-terminal, suggérant que le domaine C-terminal est principalement utilisé pour la liaison des facteurs de transcription (Fig. 5A, C).Les protéines HMGA entrent en compétition avec l’histone H1 pour se lier à l’ADN adaptateur, augmentant ainsi l’accessibilité57.De même, il semble probable que HMGA interagisse avec l’histone H2B le long de l’ADN du lieur en compétition avec l’histone H1.HMGB1 induit l'expression de HLA-A, -B et -C dans les cellules dendritiques, conduisant à leur activation, mais aucune interaction entre HMG et HLA n'a été rapportée auparavant.Nous avons constaté que HMGA1 interagit avec les domaines α1 et α3 de HLA-A, la plupart des interactions se situant en dehors de ses 3 DBD (Figure 5A, C).Entre nos mains, HLA-A s'est avéré localisé dans le noyau (données non présentées), et étant donné que H2B et HMGA1 sont également présents dans le noyau, cette interaction se produit probablement dans le noyau.Les adduits spécifiques mesurés entre H2B, HLA-A et HMGA1 sont illustrés à la figure 5D.
La plupart des interactions de HLA-A avec d'autres protéines se produisent dans ses domaines α1 et α2 et dans le domaine C-terminal désordonné (Fig. 6).Dans l'un de ces exemples, nous avons constaté que HLA-A interagit avec la queue N-terminale désordonnée de LRCH4 (Figure 6A, D).LRCH4 régule l’activation de TLR4 et l’induction des cytokines LPS, modulant ainsi la réponse immunitaire innée60,61.Il s'agit d'une protéine membranaire avec neuf répétitions riches en leucine (LRR) et un motif d'homologie calmoduline (CH) dans son ectodomaine, suivi d'un domaine transmembranaire (TMD) 60, 62.Il a été rapporté que les domaines CH intervenaient dans les interactions protéine-protéine 60 .Une étendue d'environ 300 acides aminés entre les domaines LRR et CH est relativement accessible mais désordonnée.En nous basant sur la fonction des régions désordonnées en tant que médiateurs des réseaux protéine-protéine et du transport vésiculaire 63 , nous avons constaté que la plupart des interactions protéiques se produisent dans des régions désordonnées.Les interactions avec MDN1 étaient réparties sur toute la longueur de la protéine, y compris les domaines LRR1, LRR6, CH et les régions aléatoires, tandis que H2B se liait principalement au domaine CH (Fig. 6A, B).Notamment, aucune des interactions n’incluait l’ATM, ce qui suggère la spécificité de l’approche CLMS (Figure 6A, B).
MDN1 a également été identifié comme faisant partie du réseau protéique HLA-A (Figure 6A).Elle appartient à la famille des protéines AAA (ATPases associées à différentes activités).Il s'agit du même domaine AAA N-terminal qui s'organise en un anneau hexamérique et supprime le facteur d'assemblage de la sous-unité ribosomale 60S 64.semble être similaire à la dynéine64,65,66.De plus, la région riche en Asp/Glu est suivie par le domaine MIDAS (site dépendant des ions métalliques).En raison de la grande taille de MDN1 (environ 5 600 acides aminés) et de son homologie limitée avec des protéines bien étudiées, on sait peu de choses sur sa structure et sa fonction chez l’homme.Nous avons identifié HLA-A, H2B et LRCH4 comme partenaires de liaison de MDN1 et révélé leur orientation en tant que complexes protéiques dans PyMol (Fig. 6A, B).Ces trois protéines interagissent avec le domaine AAA, le domaine de liaison de type dynéine et éventuellement le domaine MIDAS MDN1.Dans un rapport précédent, la purification par affinité des protéines d’appât a identifié MDN1 comme une protéine associée à l’histone H2B67.En outre, une étude récente a également signalé une interaction entre MDN et HLA-B dans des cellules HCT116 en utilisant la spectrométrie de masse purifiée par affinité, confortant ainsi nos conclusions68.L'identification de ce complexe dans les échantillons traités à l'IFNα suggère un rôle de MDN1 dans la signalisation de l'interféron.
Étant donné que les gènes HLA sont hautement polymorphes, nous avons extrait les lectures de séquençage cartographiant HLA-A, -B et -C à partir des données de séquençage d'ARN des cellules Flo-1 (données non présentées).Les séquences peptidiques cohérentes avec la lecture de séquençage ont révélé des différences significatives entre HLA-A, -B et -C dans les régions où les peptides réticulés étaient situés dans HLA-A (Figure S3).De plus, nous n’avons pas observé de réticulation protéine à protéine des molécules HLA-B/C avec les protéines H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Ceci suggère que l'interaction protéique trouvée entre HLA-A, MDN1, LRCH1 et HMGA1 est spécifique de HLA-A.De plus, l'analyse protéomique d'échantillons non réticulés (tableau S4) a montré que HLA-A a une couverture de séquence plus élevée que HLA-B ou HLA-C.Les peptides identifiés pour HLA-A étaient d’intensité élevée dans les échantillons traités et non traités par l’IFNα.
Pour garantir que les interactions identifiées ici n'étaient pas dues à une réticulation non spécifique de deux protéines très proches spatialement, nous avons en outre confirmé deux nouveaux facteurs d'interaction HLA-A en effectuant des tests de co-immunoprécipitation.Des interactions HLA-A avec MDN1 et H2B endogènes ont été détectées dans les cellules Flo-1 traitées et non traitées par IFNα (Figure 7, Figure S4).Nous avons confirmé que HLA-A était capturé par H2B dans les immunoprécipités et que cette association était due au traitement par IFNα puisque HLA-A était absent dans les échantillons d'immunoprécipités provenant de cellules non traitées (Figure 7A).Cependant, nos données suggèrent que l'IFNα régule différemment la liaison de HLA-A à H2B et MDN1.L'IFNα induit une association entre H2B et HLA-A, mais réduit son association avec MDN1.Nous avons constaté que MDN1 était associé à HLA-A chez les contrôles et que l'ajout d'IFNα réduisait cette interaction indépendamment de l'induction de MDN1 par IFNα (Figure 7B, C).De plus, l'immunoprécipitation HLA-A a capturé H2B dans les cellules A549 (Fig. S4), suggérant que cette interaction est indépendante du type de cellule.Pris ensemble, ces résultats soutiennent les interactions médiées par l'interféron de HLA-A avec H2B et MDN1.
HLA-A co-purifie H2B et MDN1.Des immunoblots endogènes représentatifs H2B (A) et MDN1 (B) ont été immunoprécipités à partir de cellules Flo-1 traitées à l'IFNα et sondés pour les anticorps indiqués.Des IgG de souris et de lapin ont été utilisées comme contrôle négatif.(C) Les quantités relatives (entrée) de différents antigènes sont représentées par des immunoblots sondés contre les anticorps indiqués, la β-actine a été utilisée comme contrôle de chargement.
Les propriétés structurelles de l'un des réseaux réticulés hautement fiables induits par l'interféron, H2B-HLA-A-HMGA1, ont été étudiées.Nous avons utilisé la modélisation de la dynamique moléculaire comme approche alternative pour comprendre la dynamique conformationnelle des protéines impliquées dans ce complexe (Figure 8).Les inférences à partir des données CLMS suggèrent la possibilité de différentes conformations des protéines H2B, HLA-A et HMGA1.Par conséquent, les complexes potentiels suivants ont été modélisés en milieu solvant : H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A et H2B-HLA-A-HMGA1.Un premier criblage d'amarrage protéine-protéine utilisant le package MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Québec, Canada) a suggéré des conformations possibles qui diffèrent entre ces protéines (Fig. 8A).La visualisation du complexe protéique d'accueil a révélé plusieurs interactions et conformations possibles (Figure 5A, 8).Ainsi, une conformation possible est représentée sur la figure 8A (avec des liaisons croisées étiquetées) et elle a été évaluée plus en détail à l'aide du pipeline de modélisation MD.De plus, la liaison de H2B ou de HMGA1 à HLA-A met en évidence la plus grande affinité de H2B pour HLA-A (Fig. 8A).
Dynamique conformationnelle des réseaux possibles entre les complexes H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A et H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Le panneau de gauche est une carte 2D (générée dans le logiciel SIM-XL) des liaisons croisées intramoléculaires (rouges) et intermoléculaires (bleues) (seuil de liaison croisée fixé à 3,5).De plus, les résidus de réticulation identifiés sont marqués sur les structures des protéines H2B, HLA-A et HMGA1.Les conformations associées à ces protéines ont été extraites à l'aide du pipeline d'amarrage implémenté dans le package MOE.Le panneau inférieur gauche montre les différentes conformations possibles des complexes H2B-HLA-A et HMGA1-HLA-A avec différentes affinités de liaison protéine-protéine (GBVI/WSA dG ; kcal/mol).(B) Écart type (RMSD) des positions atomiques (à l’exclusion des atomes d’hydrogène) pour chaque structure protéique.(C) Interactions intermoléculaires de liaisons hydrogène protéine-protéine provenant de divers complexes simulés considérant des interactions spécifiques de durée ≥ 10 ns.La distance seuil donneur-accepteur de liaison h a été fixée à 3, 5 Å et l'angle de coupure donneur-accepteur H a été fixé à ≥ 160 ° – 180 °.(D) Résidus marqués formant des interactions protéine-protéine HLA-A avec leurs partenaires respectifs, s'étendant sur ≥ 20 ns, extraits de complexes factices HLA-A-H2B et HLA-A-HMGA1.Les structures protéiques représentent une structure moyenne de 100 ns MDS.(E) Interactions entre les complexes HLA-A-H2B et HLA-A-HMGA1 par rapport aux interactions suivies par simulation H2B-HLA sur 100 ns sur la base du site d’interaction K ou S entre les deux peptides.Complexes /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.La valeur seuil pour l'évaluation des liaisons croisées a été fixée à 3,0 et les interactions spécifiques du MDS prenant ≥ 10 ns ont été prises en compte.Les structures protéiques ont été visualisées à l'aide des progiciels BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, Californie, États-Unis) et Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Québec, Canada).
La stabilité des molécules HLA-A au fil du temps (écart type ; RMSD ou écart type ; RMSF) a indiqué que la présence de protéines H2B ou HMGA1 dans les complexes stabilisait HLA-A (Figure 8B, Figure S5).La protéine HMGA1 se lie étroitement au site B2M de HLA-A, induisant la stabilité des acides aminés HLA-A dans le complexe HLA-A-HMGA1 ou H2B-HLA-A-HMGA1 (Figure 8B, Figure S5).en particulier, les résidus HLA ~60-90 et ~180-210 se sont révélés moins flexibles en présence de H2B (figure 8B).H2B et HMGA1 ont montré une meilleure liaison à HLA-A dans le complexe H2B-HLA-A-HMGA1 par rapport à la liaison de HLA-A à H2B ou HMGA1 seul (Figure 8C, D ; Tableau S5).Les résidus impliqués dans la liaison hydrogène (occupation élevée modélisée MD ≥ 10 ns) coïncident avec les sites d'interaction CLMS (résidus K ou S) dans le complexe, ce qui suggère que les interactions identifiées par CLMS sont très fiables.Fiabilité (Fig. 8E).Dans les modélisations CLMS et MD, il a été constaté que les résidus HLA-A compris entre environ 190 et 210 et environ 200 et 220 acides aminés se lient respectivement à H2B et HMGA1 (figure 8E).
Les interactions protéine-protéine forment des réseaux structurels dynamiques qui assurent la médiation de la communication intracellulaire en réponse à certains stimuli.Étant donné que de nombreuses approches protéomiques détectent les changements dans le niveau global d’état d’équilibre d’une protéine, la dynamique des interactions protéine-protéine nécessite des outils supplémentaires pour capturer les interfaces de liaison, et CLMS est l’un de ces outils.Le système de signalisation de l'interféron est un réseau de cytokines qui permet aux cellules de répondre à une gamme de signaux pathologiques environnementaux et intrinsèques, aboutissant à l'induction de sous-ensembles de protéines inductibles par l'interféron.Nous avons appliqué le CLMS pour déterminer si de nouvelles interactions protéine-protéine pouvaient être identifiées parmi un panel de protéines induites par l'interféron.L'analyse globale de la réticulation des protéines dans un modèle cellulaire Flo-1 sensible à l'interféron a été utilisée pour capturer les complexes protéiques.L'extraction de peptides trypsiques à partir de cellules non réticulées et réticulées permet le comptage des peptides, l'enrichissement des voies et la distribution de la longueur des peptides avec une intensité LFQ définie.Les protéines canoniques inductibles par l'interféron ont été identifiées comme contrôle interne positif, tandis que de nouveaux adduits réticulés intermoléculaires et intramoléculaires de protéines canoniques inductibles par l'interféron telles que MX1, UP18, OAS3 et STAT1 ont été observés.Diverses caractéristiques structurelles et interactions dans les domaines fonctionnels ont été étudiées.
Une interaction entre HLA-A, MDN1 et H2B a été détectée par immunoblot dans des cellules Flo-1 et A549 traitées et non traitées par IFNα.Nos résultats mettent en évidence que HLA-A se complexe avec H2B de manière dépendante de l'IFNα.Nos travaux représentent une piste intéressante pour approfondir l’exploration de la co-localisation de ces deux complexes.Il serait également intéressant d’étendre l’approche CLMS à un panel de lignées cellulaires afin d’identifier les interactions protéiques médiées par l’interféron, indépendantes du type cellulaire.Enfin, nous avons utilisé la modélisation MD comme approche alternative pour comprendre la dynamique conformationnelle des protéines impliquées dans le complexe H2BFS-HLA-A-HMGA1, qui suivait les interactions intramoléculaires et intermoléculaires.Les inférences à partir des données CLMS suggèrent la possibilité de différentes conformations des protéines H2BFS, HLA-A et HMGA1.Les différentes conformations possibles entre ces complexes protéiques d'accueil ont révélé plusieurs interactions similaires à celles observées dans l'ensemble de données CLMS.L’un des principaux atouts de notre méthode est qu’elle permet une identification facile des gènes hautement polymorphes en interaction tels que HLA. Il sera donc intéressant d’étudier les interactions de protéines spécifiques à l’haplotype HLA qui seraient autrement difficiles à étudier.Prises ensemble, nos données démontrent que le CLMS peut être utilisé pour élargir notre compréhension des réseaux de signalisation induits par l'interféron et fournir une base pour l'étude de systèmes intercellulaires plus complexes dans le microenvironnement tumoral.
Les cellules Flo-1 ont été obtenues auprès de l'ATCC et conservées dans du DMEM (Gibco) additionné de 1% de pénicilline / streptomycine (Invitrogen), 10% de sérum bovin fœtal (Gibco) et conservées à 37 ° C et 5% de CO2.Incubation.Les cellules ont été cultivées jusqu'à une confluence de 70 à 80 % avant d'être traitées avec de l'IFNα14 (fabriqué par Edinburgh Protein Production Facility).Tous les autres produits chimiques et réactifs ont été achetés auprès de Sigma Aldrich, sauf indication contraire.
Les cellules Flo-1 ont été cultivées dans des plaques à 6 puits et le lendemain, les cellules ont été traitées avec 10 ng/ml d'IFNα14 pendant 24 heures jusqu'à environ 80 % de confluence.Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et ligaturées avec du DSS fraîchement préparé (Thermo Fisher Scientific) (dissous dans du DMSO) dans du PBS pendant 5 min à 37°C jusqu'à une concentration finale de 0,5 mM.La réaction de réticulation du DSS a été remplacée par du PBS et le DSS résiduel a été désactivé en ajoutant 20 mM de Tris (pH 8,0) dans du PBS pendant 15 min à 37 °C.Les cellules ont été collectées par grattage et collectées dans des tubes à faible liaison (Axygen).
Le culot cellulaire a été lysé avec 300 µl de tampon de lyse à l'urée (urée 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) pendant 30 min à température ambiante sous agitation occasionnelle.Toutes les étapes de centrifugation ont été réalisées à 14 000 xg à 8°C.Centrifuger le lysat pendant 10 minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube.Les particules claires restantes ont été dissoutes dans 150 µl du deuxième tampon de lyse (urée 2 M, 2% (p/v) SDS (dodécylsulfate de sodium)) pendant 30 minutes ou plus jusqu'à l'obtention d'une solution aqueuse homogène.Le lysat a été centrifugé pendant 20 minutes et le surnageant a été mélangé au lysat obtenu à l'étape précédente.Les concentrations de protéines ont été évaluées à l'aide du test Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant pour les procédures sur microplaques.Les échantillons ont été rapidement congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80°C.
Environ 100 µg de protéine réticulée soluble ont été traités à l'aide d'un protocole de préparation d'échantillons par filtration modifié (FASP), tel que décrit par Wisniewski et al.69 En bref, la protéine est réticulée avec 200 µl de tampon urée (urée 8 M dans Tris 0,1 M, pH 8,5), vortexée et divisée en deux.Toutes les étapes de centrifugation ont été réalisées à 14 000 xg à 25°C.La première moitié du lysat de protéine réticulée a été transférée dans un dispositif de filtre centrifuge Microcon de 10 kDa équipé d'une membrane Ultracel-10 (Merck), suivi d'une centrifugation sur le filtre pendant 25 minutes.Ajoutez ensuite la seconde moitié de la protéine dans le filtre et répétez les mêmes étapes.La récupération des protéines a été réalisée en ajoutant 100 µl de chlorhydrate de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) 17 mM dans un tampon d'urée.La récupération a été agitée sur un thermomixeur à 600 tr/min pendant 30 min à 37°C.De plus, la colonne a été centrifugée et la protéine réticulée réduite a été alkylée en utilisant 100 µl d'iodoacétamide 50 mM dans un tampon urée.La réaction d'alkylation a été réalisée à température ambiante pendant 20 minutes à l'obscurité.Faites tourner la colonne, lavez les parois de la colonne 3 fois avec 100 µl de tampon d'urée, puis centrifugez.La même opération a été réalisée 3 fois en utilisant 100 µl de bicarbonate d'ammonium 100 mM.Avant la trypsinisation, remplacez le tube de prélèvement par un nouveau.Ajouter un tampon de digestion contenant 50 mM de bicarbonate d’ammonium et 1 µl de trypsine diluée dans un tampon trypsine (Promega).Le rapport trypsine/protéine a été maintenu à environ 1:33 et les réactions de digestion ont été incubées pendant une nuit à 37°C dans une chambre humide.Le peptide réticulé a été élué du filtre par centrifugation pendant 25 minutes.La récupération des peptides a été améliorée en ajoutant 50 µl de NaCl 0,5 M au filtre, suivi d'une centrifugation pendant 25 minutes.
Des colonnes C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) ont été utilisées pour dessaler les peptides tryptiques réticulés en suivant le protocole décrit par Bouchal et al.70 avec des modifications mineures.En bref, les colonnes de centrifugation C18 ont été activées avec trois lavages d'acide formique (FA) à 0,1 % dans de l'acétonitrile (AcN) (Merck) et deux lavages de FA à 0,1 %.La colonne a été hydratée avec 0,1 % de FA pendant 15 minutes.Chargez les échantillons dans des colonnes de centrifugation et lavez 3 fois avec 0,1 % FA.Les peptides dessalés ont été élues séquentiellement avec un gradient par étapes en utilisant 50 %, 80 % et 100 % d'AcN dans 0,1 % de FA.Les échantillons ont été séchés dans un concentrateur SpeedVac Plus (Eppendorf) jusqu'à disparition complète du liquide résiduel.Les peptides élués ont été dissous dans 100 µl d'acide trifluoroacétique à 0,08 % dans 2,5 % d'AcN et les concentrations ont été mesurées sur un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Environ 1 µg de peptide réticulé par échantillon a été injecté dans le système LC-MS/MS.
Les peptides réticulés ont été séparés sur un système UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) connecté à un spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Les peptides réticulés ont été collectés sur une colonne de capture C18 pré-colonne µ de 300 µm de diamètre intérieur et de 5 mm de long, remplie de sorbant C18 PepMap100 et de sorbant PepMap de 5 µm (Thermo Scientific).Chargez le débit de la pompe réglé à 5 µl/min 0,08 % d’acide trifluoroacétique dissous dans 2,5 % d’AcN.Les peptides réticulés ont été séparés sur une colonne analytique de silice fondue d'un diamètre intérieur de 75 µm et d'une longueur de 150 mm, remplie d'un sorbant PepMap de 2 µm (Thermo Scientific).Les phases mobiles A et B étaient respectivement constituées de 0,1 % de FA dans l'eau et de 0,1 % de FA dans l'acétonitrile.Le gradient commence à 2,5 % B et augmente linéairement jusqu'à 40 % B sur 90 minutes, puis jusqu'à 90 % B sur les 2 minutes suivantes.La composition de la phase mobile a été maintenue à 90 % de B pendant 10 minutes, puis a diminué linéairement jusqu'à 2,5 % de B sur 2 minutes.La colonne a été équilibrée à 2,5 % de B pendant 8 minutes avant le cycle suivant.Les peptides réticulés élués de la colonne analytique ont été ionisés dans une source d'ionisation par nanoélectrospray (NSI) et injectés dans un spectromètre de masse Exploris 480 (Thermo Scientific).
Le spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480 fonctionnait en mode de corrélation de données positive.Une analyse complète a été réalisée en mode section à une résolution de 120 000 avec des réglages de plage allant de m/z 350 Th à m/z 2 000 Th.L'objectif AGC normalisé a été fixé à 300 % avec un temps d'entrée maximum de 50 ms.La détection des pics monoisotopiques a été établie pour les peptides.Le paramètre de relaxation des contraintes est défini sur true si trop peu de précurseurs sont trouvés.La force ionique minimale du précurseur a été fixée à 5,0e3 et des états de charge du précurseur allant jusqu'à +8 ont été inclus dans les expériences.
Le temps de cycle entre les analyses majeures en mode de corrélation de données a été fixé à 2,5 secondes.L'exclusion de masse dynamique a été fixée à 20 s après la première fragmentation de l'ion précurseur.La fenêtre d'isolement des précurseurs a été fixée à 2 Th.Le type d’énergie de collision normalisée avec un mode d’énergie de collision fixe a été choisi lors d’une analyse MS/MS dépendant des données.Énergie de collision réglée à 30 %.La résolution Orbitrap a été fixée à 15 000 et l'objectif AGC à 100 %.Le temps d'injection maximal personnalisé est fixé à 60 millisecondes.
Avant de suivre le réseau protéine-protéine dans des échantillons réticulés, nous avons traité les fichiers bruts à l'aide du package MaxQuant (version 1.6.12.0)26,27 pour identifier les peptides/protéines traçables dans les échantillons.De plus, des analyses protéomiques similaires ont été effectuées sur des échantillons de Flo-1 non réticulés traités et non traités avec de l'IFNα.Les données MS/MS ont été recherchées dans la base de données humaine UniProt (www.uniprot.org) (téléchargée le 12 août 2020, contient 75 093 entrées) à l’aide du moteur de recherche intégré Andromeda27.La recherche a été effectuée sans indiquer la spécificité de l'enzyme et les diverses modifications de désamidation (N, Q) et d'oxydation (M).Les tolérances de masse des précurseurs ont été fixées à 20 ppm et les ions produits à 0,02 Da.L'écart de masse initial et maximum a été fixé à 10 ppm.La masse maximale du peptide a été fixée à 4 600 Da et la similarité de séquence a été fixée entre 7 et 25 acides aminés (aa).Une analyse statistique plus approfondie a été réalisée à l'aide du programme Perseus (version 1.6.10.45).La teneur en protéines a été calculée en normalisant l'intensité spectrale de la protéine (intensité LFQ ; quantification non étiquetée)27 et les valeurs d'intensité ont été converties en Log2.Un regroupement hiérarchique de protéines identifiées par leur intensité peptidique a été construit à l'aide du package pheatmap (v1.0.12) dans R (v 4.1.2).L'analyse de l'enrichissement de la voie a été réalisée à l'aide de la base de données de voies Reactome pour les protéines traitées à l'IFNα qui étaient plus de quatre fois activées par rapport aux échantillons non traités.
L'identification des réticulations chimiques spécifiques à la lysine (K) ou à la sérine (S) des complexes protéiques surveillés par LC-MS/MS a été réalisée à l'aide d'un appareil d'identification spectroscopique (SIM-XL) pour les peptides réticulés (SIM-XL)29.Premièrement, les interactions possibles entre les gènes de signature de résistance aux dommages de l'ADN (IRDS) associés à l'interféron (IFN) ont été étudiées à l'aide de l'ensemble de données sur les protéines IRDS décrit dans Padariya et al.28.Le criblage de toutes les conditions et répétitions de l’UniProt humain entier nécessite des calculs intensifs, de sorte que l’intégralité de la base de données UniProt humaine (www.uniprot.org) (téléchargée le 12 août 2020, contient 75 093 entrées) contre les répétitions traitées par IFNα.L'un des filtres pour les interactions à haute confiance.Ces interactions hautement significatives obtenues ont été développées et testées dans toutes les répétitions et conditions.
Dans SIM-XL, DSS a été utilisé pour l'agent de réticulation (XL) et le transfert de poids XL et le transfert de poids de modification ont été fixés à 138,06 et 156,07, respectivement.Les sites de réaction de réticulation suivants sont considérés : KK, KS et KN-TERM, sans ions rapporteurs.Les ppm de précurseur et de fragment ont été fixés à 20 et le seuil Xrea a été fixé à 0,15.La trypsine a été considérée comme complètement spécifique et une méthode de fragmentation par piège C à haute énergie (HCD) a été mise en œuvre.Le seuil de réduction dynamique de la DB XCorr et le nombre minimum de peptides pour la réduction dynamique de la DB ont été fixés à 2,5 et 2, respectivement.Les autres paramètres sont : la probabilité de mono-isotope et le seuil de coïncidence maximale, un minimum de 4 résidus AA par brin et une charge maximale de brin, et 3 maxima de divisions manquées.Les cartes 2D assemblées résultantes ont été analysées dans (SIM-XL) et la représentation graphique xQuest28 a été utilisée pour créer les cartes 2D.Les réticulations protéiques sur les structures protéiques sont fournies dans PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
Les structures de modèles protéiques ont été créées à l'aide du serveur Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 en utilisant les principes de modélisation d'homologie et de mise en œuvre de la « méthode de Markov cachée ».Phyre2 génère des structures modèles basées sur l'alignement des séquences avec des structures protéiques connues.Pour les protéines H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 et MDN1, les structures matrices 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 et 6i2665 ont été utilisées.De plus, la structure d'AlphaFold71 MX1, UBP18 et ROBO1 a également été prise en compte.La structure de la protéine a été visualisée à l'aide du package BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, Californie, États-Unis) et du package Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Québec, Canada).