ASTM A790 2507/2205 1,4462/1,4410 Tube soudé duplex pour le composant chimique de l'industrie chimique, la carence en SPECC1L entraîne une stabilité accrue des joints épissés et une réduction de la perte des cellules de la crête neurale crânienne.

Merci d'avoir visité Nature.com.Vous utilisez une version de navigateur avec une prise en charge CSS limitée.Pour une expérience optimale, nous vous recommandons d'utiliser un navigateur mis à jour (ou de désactiver le mode de compatibilité dans Internet Explorer).De plus, pour garantir un support continu, nous affichons le site sans styles ni JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1,4462/1,4410 tube soudé duplex pour l'industrie chimique

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.est un fabricant leader spécialisé dans les tuyaux sans soudure en acier inoxydable, les tubes recuits brillants, les tubes enroulés sans soudure, etc.Afin de faciliter la tâche des clients, nous avons également des tuyaux et des tubes soudés.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.dispose des équipements de production et de test les plus avancés.Nous pouvons totalement satisfaire votre exigence.Conformément aux normes très strictes, les tubes que nous produisons ont toujours une tolérance OD et WT correcte.Le contrôle de tolérance est strictement conforme aux normes de production.Nos produits sont toujours satisfaits des clients.Les clients ont acheté nos produits et ont créé plus de profits.
a) OD (diamètre extérieur) : 3,18 mm à 101,6 mm
b) WT (épaisseur de paroi) : 0,5 mm à 20 mm
c) Longueur : Selon l'exigence du client
d) Normes : ASTM A312;ASTM A269 ;ASTM A789 ;ASTM A790 etc.
e) Méthode de traitement : REG, EFW, etc.

Curseurs affichant trois articles par diapositive.Utilisez les boutons Précédent et Suivant pour vous déplacer dans les diapositives, ou les boutons du contrôleur de diapositives à la fin pour vous déplacer dans chaque diapositive.
Les cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) se détachent des plis neuraux embryonnaires et migrent vers les arcs pharyngés, qui forment la plupart des structures médianes de la face.Le dysfonctionnement du CNCC joue un rôle important dans l’étiologie de la fente oro-faciale, une malformation congénitale courante.Des mutations hétérozygotes SPECC1L ont été trouvées chez des patients présentant des fentes atypiques et syndromiques.Nous rapportons ici une coloration améliorée des composants canoniques de la jonction adhésive (AJ), de la β-caténine et de la E-cadhérine dans des cellules knockdown SPECC1L cultivées, et des micrographies électroniques montrent une diffusion apicale-basale de l'AJ.Pour comprendre le rôle de SPECC1L dans la morphogenèse craniofaciale, nous avons créé un modèle de souris déficient en Specc1l.Les mutants homozygotes sont mortels pour l'embryon et présentent une fermeture du tube neural et une stratification CNCC altérées.La coloration de la protéine AJ est augmentée dans les plis neuraux mutants.Ce défaut AJ est cohérent avec un défaut de délaminage CNCC, nécessitant la dissolution de l'AJ.De plus, les mutants Specc11 ont réduit la signalisation PI3K-AKT et augmenté l'apoptose.In vitro, une légère inhibition de la signalisation PI3K-AKT dans les cellules de type sauvage était suffisante pour induire des modifications de l'AJ.Il est important de noter que les modifications de l’AJ induites par l’inactivation de SPECC1L peuvent être inversées par l’activation de la voie PI3K-AKT.Prises ensemble, ces données suggèrent que SPECC1L, en tant que nouveau régulateur de la signalisation PI3K-AKT et de la biologie de l'AJ, est nécessaire à la fermeture du tube neural et à la stratification du CNCC.
Les cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) se localisent dans le neuroectoderme dorsal et se détachent du neuroépithélium des plis neuraux en développement grâce à un processus impliquant la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)1,2,3.Les CNCC épithéliales prémigrantes perturbent les jonctions intercellulaires et deviennent des CNCC mésenchymateuses migrantes qui remplissent les premier et deuxième arcs pharyngés et forment la majeure partie du cartilage cranio-facial.Ainsi, les gènes qui régulent la fonction du CNCC sont souvent perturbés dans l’étiologie des anomalies congénitales cranio-faciales telles que les fentes orofaciales, affectant le plus souvent 1/800 naissances rien qu’aux États-Unis.Une des malformations congénitales8.
Le délaminage du CNCC coïncide avec la fermeture du tube neural antérieur entre 8,5 et 9,5 jours de développement embryonnaire chez la souris.Les mutants d'un certain nombre de gènes associés à la fente oro-faciale de souris présentent également une certaine forme d'anomalie du tube neural, notamment Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 et Pdgfrα12.Cependant, les processus de fermeture du tube neural et de stratification du CNCC peuvent être considérés comme indépendants, car la souris mutante Splotch (Pax3) présente des défauts de fermeture du tube neural sans aucun effet sur la stratification ou la migration du CNCC 13,14.Des modèles de souris supplémentaires présentant des défauts de dissection CNCC et de fermeture du tube neural aideront à délimiter la base moléculaire commune de ces deux processus.
L'isolement du CNCC à partir de cellules neuroépithéliales nécessite la dissolution des jonctions adhésives (AJ), composées de complexes protéiques contenant, entre autres, la E-cadhérine, la β-caténine, l'α-E-caténine et l'α-actinine associées à des filaments d'actine 2 Des études de surexpression de la E-cadhérine dans les plis neuraux ont montré une réduction ou un retard du délaminage des CNCC.À l’inverse, la suppression de la E-cadhérine entraîne une stratification précoce15,16.De nombreux facteurs qui interviennent dans l'EMT pendant la stratification des CNCC sont des facteurs de transcription (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) et des protéines de remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) telles que les métalloprotéinases matricielles (MMP). Cependant, les CNCC sont des régulateurs directs de l'AJ du cytosquelette. pas encore connu.La voie PI3K-AKT est connue pour antagoniser les niveaux de E-cadhérine, principalement grâce à la recherche sur le cancer17.Des études récentes ont montré que la perte de la signalisation PI3K-AKT basée sur PDGFα chez la souris entraîne des anomalies cranio-faciales, notamment une fente palatine et des anomalies du tube neural12.Cependant, la relation entre la voie PI3K-AKT et la stabilité de l'AJ lors de la stratification CNCC n'est pas claire.
Nous avons précédemment identifié SPECC1L comme le premier gène mutant chez deux personnes présentant une fente sévère qui s'étend de la bouche à l'œil, connue sous le nom de fente oblique (ObFC) ou fente Tessier IV18.Des mutations SPECC1L ont été identifiées dans deux familles multigénérationnelles atteintes du syndrome d'Opitz G/BBB autosomique dominant (OMIM #145410), dans lesquelles les individus affectés présentaient une hyperdistance et une fente labiale/palatine19, et dans une famille atteinte du syndrome de surdistance de Tibi (OMIM #145420)20. .plus de la moitié des cas de syndrome d'Opitz G/BBB sont liés à l'X (OMIM #300000) et sont causés par des mutations du gène MID1, qui code pour la protéine 22 du squelette cellulaire associé aux microtubules.Nous émettons l'hypothèse que SPECC1L, également une protéine associée aux microtubules et au cytosquelette d'actine, pourrait assurer la médiation de la signalisation nécessaire au remodelage du cytosquelette d'actine au cours de l'adhésion et de la migration cellulaires 18 .Grâce à des études in vitro et in vivo, nous décrivons maintenant SPECC1L comme un nouveau régulateur de la stabilité de l'AJ via la signalisation PI3K-AKT.Au niveau cellulaire, le déficit en SPECC1L a entraîné une diminution du niveau de protéine pan-AKT et une augmentation de la dispersion apical-basale de l'AJ, qui a été éliminée par l'activation chimique de la voie AKT.In vivo, les embryons déficients en Specc11 présentent une fermeture altérée du tube neural et une dissection réduite du CNCC.Ainsi, SPECC1L fonctionne dans une signalisation basée sur l'adhésion cellulaire hautement régulée, nécessaire au fonctionnement normal du CNCC au cours de la morphogenèse faciale.
Pour caractériser le rôle de SPECC1L au niveau cellulaire, nous avons utilisé la lignée cellulaire stable d'ostéosarcome U2OS, décrite précédemment, déficiente en SPECC1L18.Ces cellules U2OS stables avec l'inactivation de SPECC1L (kd) présentaient une diminution modérée (60 à 70 %) des niveaux de transcrits et de protéines SPECC1L, ainsi que des défauts de migration et de réorganisation du cytosquelette d'actine 18. En revanche, une diminution transitoire sévère de Il a été démontré que SPECC1L entraîne des anomalies mitotiques 23 .Après une caractérisation plus approfondie, nous avons constaté que nos cellules SPECC1L-kd stables changeaient de morphologie à un degré de confluence très élevé (Figure 1).Les cellules témoins individuelles et les cellules kd à faible confluence semblaient similaires (Figure 1A, D).24 heures après la fusion, les cellules témoins ont conservé leur forme cuboïde (Fig. 1B, E), tandis que les cellules SPECC1L-kd se sont allongées (Fig. 1C, F).L'étendue de ce changement dans la forme des cellules a été capturée par imagerie en direct in vivo de cellules témoins et de cellules kd (film 1).Pour déterminer le rôle de SPECC1L dans les cellules confluentes, nous avons d'abord examiné son expression.Nous avons constaté que les niveaux de protéine SPECC1L augmentaient lors de la fusion (Figure 1G), alors que les niveaux de transcription SPECC1L n'augmentaient pas (Figure 1H).De plus, à mesure que la densité cellulaire augmentait, la protéine SPECC1L s'accumulait aux limites intercellulaires (Fig. 2A-E), avec un motif chevauchant celui de la β-caténine associée à la membrane (Fig. 2A'-E').Compte tenu de l'association de SPECC1L avec le cytosquelette d'actine 18,23, nous avons émis l'hypothèse que SPECC1L interagit avec les jonctions adhésives à base d'actine (AJ).
(AF) Les cellules knockdown (DF) SPECC1L s'allongent à confluence élevée (F) par rapport aux cellules U2OS témoins (AC).Voici trois des six points temporels (T1, T3, T6) que nous avons sélectionnés pour différentes densités cellulaires.(G) Analyse par Western blot montrant que la protéine SPECC1L est stabilisée à un degré élevé de confluence par rapport à un faible degré de confluence dans les cellules témoins.Le Western blot de SPECC1L montre la bande attendue de 120 kDa et une bande de poids moléculaire plus élevé, éventuellement modifiée post-traductionnellement (*).L'analyse par Western blot a été réalisée dans les mêmes conditions pour une confluence faible et élevée.Les images montrant SPECC1L à confluence basse et haute ont été prises à partir du même transfert.Le même transfert a été retiré et réexaminé avec l'anticorps β-actine.(H) L’analyse RT-PCR quantitative n’a montré aucun changement significatif dans les niveaux de transcription SPECC1L.Les barres d’erreur représentent les SEM de quatre expériences indépendantes.
(AE) Nous avons choisi six points temporels (T1-T6) représentant une plage de densités cellulaires pour normaliser l’analyse de la forme des cellules et les modifications AJ dans les cellules U2OS avec l’inactivation de SPECC1L (kd).Les cinq premiers de ces points dans le temps comprenaient des cellules uniques (T1), une fusion de 50 à 70 % de petits amas de cellules (T2), une fusion sans remodelage des cellules kd (T3), un remodelage des cellules kd (T4) et des changements sur 24 heures.sous la forme postérieure des cellules kd (T5).La protéine SPECC1L était principalement dispersée dans le cytoplasme à T1 (A), mais son accumulation a été observée aux limites intercellulaires à des moments ultérieurs (B – E, flèches).(FJ) la β-caténine présente une accumulation similaire aux limites intercellulaires associées au complexe AJ.(A'-E') SPECC1L et la β-caténine présentent une coloration superposée aux frontières cellulaires à haute densité cellulaire (flèches).(F'-J') Dans les cellules SPECC1L-kd, la coloration de la β-caténine semble normale à faible densité cellulaire (F'-H'), mais s'étend à mesure que la forme des cellules change (I', J' ; flèches), indiquant que AJ ont changé.Barres = 10 µm.
Nous avons ensuite tenté de déterminer l’effet du déficit en SPECC1L sur l’AJ.Nous avons utilisé plusieurs marqueurs associés à l'AJ, notamment les composants canoniques F-actine, myosine IIb, β-caténine et E-cadhérine24,25,26,27.Les fibres de stress d'actine ont augmenté dans les cellules SPECC1L-kd comme décrit précédemment (Fig. 3A, B) 18.La myosine IIb associée aux filaments d'actine a montré une augmentation similaire du nombre de cellules SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).La β-caténine associée à l'AJ se lie à la cadhérine au niveau de la membrane cellulaire, montrant un modèle d'expression normal en « nid d'abeilles » dans les cubocytes témoins (Fig. 3E, G).Fait intéressant, dans les images plates utilisant la microscopie confocale, la coloration de la β-caténine (Fig. 3E, F) et de la E-cadhérine (Fig. 3G, H) sur la membrane cellulaire de cellules confluentes déficientes en SPECC1L a montré des modèles importants de coloration étendue.Cette expansion de la coloration de la β-caténine associée à l'AJ dans les cellules kd était la plus prononcée à la confluence, mais semblait précéder les changements de forme des cellules (Fig. 2F-J, F'-J').Pour déterminer la nature physique de cette coloration AJ étendue, nous avons examiné les frontières cellulaires sur la surface apicale-basale des cellules SPECC1L-kd U2OS par microscopie électronique à transmission (TEM) (Figure 3I, J).Contrairement aux cellules témoins (Fig. 3I), qui présentaient des régions séparées denses en électrons indiquant AJ (flèches), les cellules kd (Fig. 3J) présentaient de grandes régions contiguës de haute densité électronique indiquant AJ le long du plan apicobasal..De plus, sur des coupes transversales, nous avons observé de vastes plis de membrane cellulaire dans les cellules kd (Fig. S1A, B), ce qui explique le motif étendu des bandes de coloration de la β-caténine et de la E-cadhérine (Fig. 3F, H).À l'appui du rôle de SPECC1L dans les AJ, la β-caténine a été co-immunoprécipitée avec SPECC1L dans des lysats de cellules U2OS confluentes (Fig. 3K).Parallèlement à l'immunocoloration étendue des marqueurs AJ, l'analyse TEM était cohérente avec notre hypothèse selon laquelle le déficit en SPECC1L augmente la densité et la variance apicale-basale de l'AJ.
(AH) Augmentation de la coloration de la F-actine dans les cellules kd 48 heures après la fusion (T6 ; A, B).Coloration altérée de la myosine IIb associée à la F-actine (C, D).Le motif lisse de la coloration de la membrane de la β-caténine et de la E-cadhérine dans les cellules témoins (E, G) a été amélioré dans les cellules SPECC1L-kd (F, H).Barres = 10 µm.(I – J) Micrographies électroniques observant la jonction intercellulaire apical-basale.Les cellules de contrôle présentent des régions distinctes, denses aux électrons, indiquant des jonctions collantes (I, flèches).En revanche, la totalité de la jonction apical-basale dans les cellules SPECC1L-kd semblait dense en électrons (J, flèches), indiquant une densité et une dispersion accrues des jonctions adhésives.(K) La β-caténine a été co-immunoprécipitée avec SPECC1L dans des lysats de cellules U2OS confluentes.Image prise à partir d'un endroit représentant l'une des quatre expériences indépendantes.
Pour comprendre le rôle de SPECC1L dans la morphogenèse craniofaciale, nous avons créé un modèle de souris déficient en Specc1l en utilisant deux lignées cellulaires pièges ES indépendantes, DTM096 et RRH048 (BayGenomics, CA), qui représentent l'intron 1 et les transcrits de Specc1l ont été capturés à 15 (Fig. 1). .4A, figure S2).L'emplacement génomique de l'insert de vecteur leurre a été déterminé par séquençage du génome entier et confirmé par PCR (Fig. S2).Les deux conceptions de pièges génétiques ont également permis la fusion dans le cadre des rapporteurs Specc11-lacZ lors de la capture.Par conséquent, l’expression de lacZ déterminée par coloration X-gal a été utilisée comme indicateur de l’expression de Specc11.Les deux allèles présentaient des modèles d'expression lacZ similaires, le piège génétique DTM096 dans l'intron 1 montrant une expression plus forte que RRH048 dans l'intron 15 (non représenté).Cependant, Specc1l est largement exprimé, avec une expression particulièrement forte dans les plis neuraux en E8.5 (Figure 4B), dans le tube neural et les processus faciaux en E9.5 et E10.5 (Figure 4C, D) et dans les membres en développement. à E10.5 et les yeux (figure 4D).Nous avions précédemment signalé que l'expression de SPECC1L dans le premier arc pharyngé à E10.5 était présente dans l'épithélium et le mésenchyme sous-jacent18, ce qui correspond à la lignée CNCC.Pour tester l’expression de SPECC1L dans CNCC, nous avons réalisé des plis neuraux E8.5 (Figure 4E-J) et des sections de crâne E9.5 (Figure 4K-).À E8.5, SPECC1L a intensément coloré les plis neuraux (Fig. 4E, H), y compris les cellules colorées avec des marqueurs NCC (Fig. 4G, J).À E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) a fortement coloré le CNCC migrateur co-coloré avec AP2A (Fig. 4L, M) ou SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Représentation schématique du gène Specc11 de souris montrant l’insertion du vecteur leurre dans les clones cellulaires ES DTM096 (intron 1) et RRH048 (intron 15).(BD) coloration lacZ d'embryons hétérozygotes Specc1lDTM096 représentant l'expression de Specc1l de E8.5 à E10.5.NE = neuroectoderme, NF = pli neural, PA1 = premier arc pharyngé.(EP) Immunocoloration SPECC1L avec les marqueurs NCC AP2A et SOX10 dans les plis neuraux E8.5 (NF; EJ) et les sections de crâne E9.5 (KP).La coloration SPECC1L a été largement observée dans les plis neuraux E8.5 (E, H ; pointes de flèches), y compris les cellules marquées avec AP2A (F, G ; pointes de flèches) et SOX10 (I, J ; pointes de flèches).À E9.5, SPECC1L a fortement coloré les CNCC migrateurs (K, N ; flèches) étiquetés AP2A (L, M ; flèches) et SOX10 (O, P ; flèches).
Le croisement entre des souris hétérozygotes Specc1lDTM096/+ et Specc1lRRH048/+ montre que les deux allèles du piège génétique ne sont pas complémentaires et que les hétérozygotes composés et les homozygotes embryonnaires pour l'un ou l'autre allèle du piège génétique sont mortels pour l'embryon (Tableau S1).Les rapports mendéliens ont indiqué une diminution du taux de survie des hétérozygotes à la naissance (attendu 1,34 contre 2,0).Nous avons noté une faible mortalité périnatale chez les hétérozygotes, certains présentaient des anomalies cranio-faciales (Fig. S3).Cependant, la faible pénétrance de ces phénotypes cranio-faciaux périnatals rend difficile l’étude de leurs mécanismes physiopathologiques sous-jacents.Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur le phénotype embryonnaire mortel des mutants homozygotes Specc11.
La plupart des embryons mutants composés hétérozygotes ou homozygotes Specc1lDTM096 / RRH048 ne se sont pas développés après E9.5–10.5 (Fig. 5A – D), et le tube neural ne s'est pas fermé antérieurement (Fig. 5B, D) et s'est parfois fermé postérieurement (non représenté). ..Ce défaut de fermeture du tube neural crânien était associé au fait que la majorité des DLX2 marqués par CNCC restaient dans les plis neuraux à E10,5, indiquant l'absence de dissection (Figure 5A'-D').Pour déterminer si la taille globale du CNCC était également réduite, nous avons marqué les lignées CNCC avec GFP dans nos lignées de piégeage génétique avec Wnt1-Cre et ROSAmTmG.Nous diffusons des GFP+ NCC et GFP- (RFP+) non-NCC triés à partir d'embryons entiers.À E9.5, la proportion de CNCC marqués par GFP triés en flux n'a pas changé de manière significative entre les embryons WT et mutants (non représentés), indiquant une spécification CNCC normale.Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que les colorations résiduelles de Wnt1-Cre et DLX2 dans les plis neuraux exposés (Figure 5B') étaient dues à une stratification CNCC défectueuse, probablement due à une densité ou une dispersion accrue des cellules AJ, comme on le voit dans les cellules SPECC1L-kd.Nous avons utilisé les marqueurs NCC SOX10, AP2A et DLX2 pour confirmer la présence de CNCC dans le pli neural (Figure 5E-R).À E8.5, une coloration du pli neural pour les trois marqueurs NCC a été observée dans des coupes de WT (Fig. 5E, G, I) et du mutant Specc1l (Fig. 5F, H, J).À E9.5, alors que les marqueurs NCC coloraient les NCC migrant dans les coupes WT (Fig. 5M, O, Q), une coloration résiduelle de NCC a été observée dans les plis neuraux exposés d'embryons mutants Specc1l (Fig. 5N, P, R).Étant donné que SOX10 et DLX2 marquent les CNCC en migration, ce résultat suggère que les CNCC déficients en SPECC1L atteignent la spécification post-migratoire mais ne parviennent pas à migrer à partir des replis neuronaux.
Le déficit en Specc11 entraîne une fermeture défectueuse du tube neural, un délaminage des cellules de la crête neurale crânienne et des AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryon porteur de cellules migrantes de la crête neurale crânienne (CNCC) marquées avec Wnt1-Cre (A').En revanche, les embryons mutants Specc11 présentent des plis neuraux ouverts (B), pointes de flèches) et des CNCC qui n'ont pas migré (B ', pointes de flèches).(C, D') Images en champ clair (C, D') et immunocoloration (C', D') du marqueur CNCC DLX2 des embryons E10.5 WT (C, C') et Specc1l (D, D').Dans les embryons WT E10.5, les CNCC DLX2-positifs colonisent les arcs branchiaux (C', flèches), tandis que chez les mutants, une coloration visible persiste dans les plis neuraux ouverts (D', flèches) et dans les premiers arcs pharyngés (D', flèches).) avec quelques taches (flèches) indiquant un mauvais délaminage et une mauvaise migration du CNCC.ER) Des sections d'embryons mutants WT et Specc1l aux stades E8.5 (E – L) et E9.5 (M – R) ont été marquées avec les marqueurs NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) et DLX2 (I, J, Q, R).À E8.5, une coloration NCC a été observée dans les sections de repli neural (NF) et de mutants de type sauvage.La co-coloration de SOX10 et de la β-caténine dans E8.5 WT (K) et le mutant (L) a révélé une coloration accrue de la β-caténine aux limites cellulaires des plis neuraux.À E9.5, une coloration de type sauvage des CNCC en migration (M, O, Q) a été observée, tandis que chez les mutants, des CNCC non stratifiés ont coloré les plis neuraux ouverts (N, P, R).(S – Z) Analyse de marquage AJ in vivo dans des coupes coronales d'embryons WT et Specc11DTM096/RRH048 avec la mutation E9.5.Un plan de coupe approximatif est affiché dans le coin supérieur droit.Dans des coupes de tissus mutants, une coloration accrue de la F-actine (S, T) et de la myosine IIb (U, V) a été observée.Semblable aux résultats in vitro de la figure 3, chez les embryons mutants, une coloration membranaire améliorée pour la β-caténine (W, X) et la E-cadhérine (Y, Z) a été observée.(AA-BB) Une micrographie électronique d'une section d'un embryon de type sauvage regardant au-delà de la frontière de la cellule apicale-basale montre une région distincte, dense aux électrons, indicative de jonctions adhésives (AA, flèches).En revanche, dans les sections d’embryons mutants Specc11 (BB, flèches), la totalité de la jonction apicobasale est dense en électrons, ce qui indique une densité et une dispersion accrues des jonctions adhésives.
Pour tester notre hypothèse selon laquelle la réduction des couches est due à une altération de l'AJ, nous avons examiné le marquage de l'AJ dans les replis neuraux exposés d'embryons mutants Specc1l (Fig. 5S-Z).Nous avons observé une augmentation des fibres de stress d'actine (Fig. 5S, T) et une localisation concomitante accrue de la coloration de myosine IIB sur les fibres d'actine (Fig. 5U, V).Il est important de noter que nous avons observé une coloration accrue de la β-caténine (Fig. 5W, X) et de la E-cadhérine (Fig. 5Y, Z) aux limites intercellulaires.Nous avons également examiné la coloration à la β-caténine du NCC dans les plis neuraux des embryons E8.5 (Fig. 5K, L).La coloration à la β-caténine semblait être plus forte dans les replis neuraux mutants Specc1l (Fig. 5L et K), suggérant que les modifications de l'AJ avaient commencé.Dans les micrographies électroniques de coupes de crâne d'embryons E9.5, nous avons de nouveau observé une augmentation de la coloration diffuse dense aux électrons dans les embryons mutants Specc1l par rapport aux WT (Fig. 5AA, BB et S1E-H).Pris ensemble, ces résultats confortent nos résultats in vitro dans les cellules SPECC1L-kd U2OS et suggèrent qu'une coloration aberrante de l'AJ précède la stratification du CNCC dans nos embryons mutants.
Compte tenu de la relation antagoniste connue entre l’activité de l’AKT et la stabilité de la E-cadhérine, nous avons émis l’hypothèse de l’implication de la signalisation PI3K-AKT.De plus, nous avons observé des cloques sous-épidermiques chez certains de nos embryons mutants qui ont échappé à la létalité (<5%) entre E9,5 et 10,5 et se sont plutôt installés autour de E13,5 (Fig. S3).Les vésicules sous-épidermiques sont une caractéristique de la signalisation réduite de PI3K-AKT basée sur PDGFRα12.Fantauzzo et coll.(2014) ont rapporté que la perturbation de l'activation de PI3K basée sur PDGFRα dans les embryons mutants PdgfraPI3K/PI3K entraînait des vésicules sous-épidermiques, des anomalies du tube neural et des phénotypes de fente palatine.En effet, les niveaux de pan-AKT et de Ser473-AKT phosphorylé actif ont été réduits in vivo dans les tissus mutants Specc1l jusqu'à l'arrêt embryonnaire E9.5 (Fig. 6A-D).La diminution des taux de Ser473-AKT phosphorylée peut être entièrement due à la diminution des taux de pan-AKT in vivo (figure 6E) et in vitro (figure 6F).Une diminution in vitro n'a été observée que lorsque les cellules U2OS confluent fortement avec les changements de forme cellulaire et de densité AJ (Figure 6D).Ainsi, nos données suggèrent que SPECC1L est un nouveau régulateur positif de la signalisation PI3K-AKT dans la morphogenèse craniofaciale.
(A – E) Coupes de crâne E8.5 (A, B) et E9.5 (C, D) ou lysats E9.5 d'embryons mutants Specc1l (E) montrant les niveaux de réduction active des protéines S473-AKT phosphorylée et pan-AKT , par rapport au contrôle WT.Le Western blot a été réalisé sur des lysats de type sauvage et des lysats mutants dans les mêmes conditions.Les images présentées pour SPECC1L ont été prises à partir d'un seul transfert.Le même transfert a été retiré et réexaminé avec des anticorps anti-pan-ACT et β-actine.Les niveaux de Pan-AKT dans les plis neuraux E8.5 (A, B) et les niveaux de S473-AKT phosphorylés dans les sections du crâne E9.5 ont été considérablement réduits.(F) Les niveaux de Pan-AKT ont été réduits de la même manière dans les lysats de cellules SPECC1L-kd U2OS récoltées à confluence élevée.Les barres d’erreur représentent les SEM de trois quantifications indépendantes par Western blot.(GJ) Sections d'embryons WT à E9.5 colorées respectivement avec KI67 et caspase 3 clivée, montrant une prolifération cellulaire (G, G') et peu d'activité apoptotique (H, H').Les embryons mutants Specc11 présentent une prolifération cellulaire comparable (I), mais le nombre de cellules en apoptose est significativement augmenté (J).
Nous avons ensuite examiné les marqueurs de prolifération et d'apoptose.Nous n'avons observé aucune différence dans la prolifération des embryons E9.5 (Fig. 6E, G par rapport à I) avec un indice de prolifération de 82,5% pour les mutants WT et de 86,5% pour les mutants Specc1l mesurés par coloration KI67 (p <0,56, Fisher's test exact).De même, nous n'avons observé aucune différence dans l'apoptose mesurée par coloration de la caspase 3 clivée dans les plis neuraux à E8,5 jusqu'à l'arrêt de l'embryon (non présenté) (non présenté).En revanche, l'apoptose était significativement augmentée dans tous les embryons mutants E9.5 (Fig. 6F, H et J).Cette augmentation globale de l'apoptose est cohérente avec une signalisation réduite de PI3K-AKT et une létalité embryonnaire précoce29,30,31.
Ensuite, pour confirmer le rôle causal de la signalisation PI3K-AKT dans les modifications de l'AJ dans nos cellules kd, nous avons modifié chimiquement la voie dans les cellules de contrôle et kd (Figure 7A-F).Nous avons utilisé comme marqueur le phénotype de changement de forme cellulaire observé dans les cellules confluentes SPECC1L-kd, que nous avons quantifié en utilisant le rapport entre la dimension la plus longue (longueur) et la dimension verticale correspondante (largeur).Un rapport de 1 est attendu pour les cellules relativement rondes ou cuboïdes (Figure 7G).En plus de la forme des cellules, nous avons également confirmé l'effet sur l'AJ par coloration à la β-caténine (Fig. 7A'-F').L'inhibition de la voie PI3K-AKT à l'aide de la wortmannine était suffisante pour modifier la forme des cellules dans les cellules témoins (Figure 7A, C) et AJ (Figure 7A').L'activateur PI3K-AKT SC-79 n'a pas affecté la forme des cellules (figures 7A, E) ni l'expansion de l'AJ (figure 7A') dans les cellules témoins.Dans les cellules SPECC1L-kd, une suppression supplémentaire de la voie PI3K-AKT a entraîné une augmentation de l'apoptose (Fig. 7B, D) et une augmentation marquée de la coloration de la β-caténine (Fig. 7B'), ce qui correspond à nos mutants lourds in vivo.Il est important de noter que l'activation de la voie PI3K-AKT a considérablement amélioré la forme des cellules (Figure 7B, F) et les phénotypes AJ (Figure 7B").Les changements dans la forme des cellules ont été quantifiés sous forme de rapport de rondeur cellulaire (CCR) et comparés pour leur signification comme décrit ci-dessus (figure 7G).En effet, dans les cellules témoins (Fig. 7G, CCR = 1,56), le traitement à la wortmannine était suffisant pour modifier de manière significative la forme cellulaire (Fig. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) dans une mesure similaire à celle observée. dans SPECC1L.-kd cellules (Fig. 7G, CCR = 3,46).Le traitement par Wortmannin des cellules SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, négligeable) n'était pas plus significatif que les cellules kd non traitées (Fig. 7G, CCR = 3,46, négligeable) ou les cellules témoins traitées par Wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3,46, négligeable) affecte également l'allongement cellulaire (7G, CCR = 3,61, négligeable).Plus important encore, l'activateur SC-79 AKT a restauré le phénotype allongé des cellules SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Ces résultats confirment que SPECC1L régule la signalisation PI3K-AKT et suggèrent qu'une diminution modérée de SPECC1L affecte l'adhésion cellulaire, tandis qu'une forte diminution conduit à l'apoptose (Fig. 8).
(A – F') Cellules de contrôle (A, C, E) et SPECC1L-kd (B, D, F) traitées avec l'inhibiteur de la voie PI3K-AKT, la wortmannine (C, D) ou l'activateur SC-79 (E, F) Traitement Les cellules témoins non traitées sont cuboïdes (A) avec une coloration cellulaire β-cat normale (A'), tandis que les cellules kd sont allongées (B) avec une coloration cellulaire β-cat accrue (B').Après la suppression de la voie PI3K-AKT, les cellules témoins se sont allongées (C) avec une expansion du β-cat (C'), tandis que les cellules kd ont commencé à subir une apoptose (D), semblable à nos embryons hautement mutés et présentant un β-cat extrêmement amélioré.coloration (D').Après activation de la voie PI3K-AKT, les cellules témoins sont restées cuboïdes (E) et présentaient une coloration normale du β-cat (E'), tandis que les cellules kd présentaient une forme cellulaire (F) et une coloration du β-cat (F') significativement améliorées, indiquant (G) Le degré de changement de forme des cellules (AF) a été quantifié à l’aide du rapport de rondeur des cellules (CCR) de la dimension la plus longue (longueur) et de la dimension verticale correspondante (largeur) à l’aide du logiciel MetaMorph.Les cellules SPECC1L-kd non traitées (NT) (CCR = 3,46) étaient significativement plus longues que les cellules témoins (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).L'inhibition par Wort de la voie PI3K-AKT dans les cellules témoins était suffisante pour provoquer un allongement similaire de la forme cellulaire (CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9).De même, l'activation de l'AKT par SC-79 dans les cellules SPECC1L-kd a restauré l'élongation cellulaire aux niveaux de contrôle (CCR = 1, 74, p <6, 2 × 10–12).Le traitement par le wortmannin des cellules SPECC1L-kd a entraîné une augmentation de l'apoptose, mais aucune augmentation supplémentaire du changement de forme cellulaire (CCR = 3,60) par rapport aux cellules kd non traitées (CCR = 3,46, ns) ou aux cellules témoins traitées au wortmannin (3,61) observées dans .ns = n'a pas d'importance.Les mesures +/- SEM pour 50 cellules sont affichées.Les différences statistiques ont été calculées à l'aide du test t de Student.
(A) Représentation schématique de l’inhibition et de l’activation de la voie PI3K-AKT entraînant respectivement des modifications et un sauvetage de l’AJ.(B) Modèle proposé pour la stabilisation de la protéine AKT par SPECC1L.
Les CNCC prémigratoires nécessitent une lyse AJ pour se séparer des cellules neuroépithéliales du pli neural antérieur1,15,32.La coloration accrue des composants de l'AJ et la perte de la distribution asymétrique apicale-basale de l'AJ dans les cellules déficientes en SPECC1L à la fois in vitro et in vivo, combinées à la proximité physique de SPECC1L avec la β-caténine, suggèrent que SPECC1L fonctionne pour maintenir correctement la stabilité locale de l'AJ pendant muscles de l’organisation.cytosquelette d'actine.L'association de SPECC1L avec le cytosquelette d'actine et la β-caténine et l'augmentation du nombre de filaments d'actine condensés en l'absence de SPECC1L sont cohérentes avec l'augmentation observée de la densité d'AJ.Une autre possibilité est qu’un nombre accru de fibres d’actine dans les cellules déficientes en SPECC1L entraîne une modification de la tension intercellulaire.Étant donné que le stress cellulaire affecte la dynamique de l'AJ 33, les changements de tension peuvent entraîner une AJ 34 plus diffuse.Ainsi, tout changement affectera les couches CNCC.
Wnt1 est exprimé dans les premiers plis neuraux qui donnent naissance aux cellules de la crête neurale.Ainsi, le traçage de la lignée Wnt1-cre marque à la fois NCC35 avant et en migration.Cependant, Wnt1 marque également les clones de tissus cérébraux dorsaux également dérivés des premiers plis neuraux 35,36, ce qui rend probable que notre coloration des mutants E9.5 pour les marqueurs Wnt1 dans les plis neuraux ouverts ne soit pas CNCC.Notre coloration positive pour les marqueurs NCC AP2A et SOX10 a confirmé que les replis neuraux exposés des embryons mutants Specc11 contenaient effectivement du CNCC.De plus, étant donné que AP2A et SOX10 sont des marqueurs de NCC à migration précoce, une coloration positive a indiqué que ces cellules sont des CNCC post-migratoires qui ne peuvent pas être stratifiées par E9.5.
Nos données suggèrent que la régulation moléculaire de l'AJ par SPECC1L est médiée par la signalisation PI3K-AKT.La signalisation AKT est réduite dans les cellules et tissus déficients en SPECC1L.Les conclusions de Fantauzzo et al.soutiennent le rôle direct de la signalisation PI3K-AKT dans la morphogenèse craniofaciale.(2014) ont montré que le manque d'activation de la signalisation PI3K-AKT basée sur PDGFRα conduit à un phénotype de fente palatine.Nous montrons également que l'inhibition de la voie PI3K-AKT est suffisante pour modifier l'AJ et la forme cellulaire dans les cellules U2OS.Conformément à nos résultats, Cain et al.37 ont montré que la régulation négative de la sous-unité PI3K α110 dans les cellules endothéliales entraîne une augmentation similaire de la coloration de la β-caténine péricellulaire, appelée augmentation de « l'indice de connectivité ».Cependant, dans les cellules endothéliales dont les filaments d'actine sont déjà hautement organisés, la suppression de la voie PI3K-AKT entraîne une forme lâche des cellules.En revanche, les cellules SPECC1L-kd U2OS présentaient une forme cellulaire allongée.Cette différence peut être spécifique au type de cellule.Alors que la suppression de la signalisation PI3K-AKT affecte de manière permanente le cytosquelette d'actine, l'effet sur la forme cellulaire est déterminé par les changements de tension provoqués par les changements dans la densité et l'organisation des fibres d'actine centrales.Dans les cellules U2OS, nous avons utilisé uniquement les changements de forme cellulaire comme marqueur du changement et de la récupération de l'AJ déficient en SPECC1L.En conclusion, nous émettons l’hypothèse que l’inhibition de la voie AKT dans le déficit en SPECC1L augmente la stabilité de l’AJ et réduit le délaminage dans le CNCC.
Il est intéressant de noter que les niveaux de pan-AKT ont été réduits in vitro et in vivo en plus des niveaux de 473-AKT phosphorylés en l'absence de SPECC1L, suggérant une régulation de la signalisation PI3K-AKT au niveau de la stabilité ou du renouvellement de la protéine AKT.Les gènes SPECC1L et MID1, tous deux associés au syndrome Opitz/GBBB, codent pour des protéines qui stabilisent les microtubules 18,22.Le mécanisme par lequel SPECC1L et MID1 assurent la stabilisation des microtubules n’est pas entièrement compris.Dans le cas de SPECC1L, cette stabilisation comprend une acétylation améliorée d'un sous-ensemble de microtubules 18.Il est possible que SPECC1L utilise un mécanisme similaire pour stabiliser d'autres protéines telles que l'AKT.Il a été démontré que l'acétylation des résidus lysine dans la protéine AKT entraîne une diminution de la localisation membranaire et de la phosphorylation38.De plus, l'ubiquitination de la chaîne K63 au niveau du même résidu lysine sur l'AKT est nécessaire pour sa localisation et son activation membranaires .Parmi plusieurs facteurs interagissant avec les protéines SPECC1L identifiés dans divers cribles à deux hybrides de levure à haut débit, quatre – CCDC841, ECM2942, APC et UBE2I43 – ont été impliqués dans le renouvellement ou la stabilité des protéines via l'ubiquitination ou la sumoylation.SPECC1L peut être impliqué dans la modification post-traductionnelle des résidus de lysine de l'AKT, affectant la stabilité de l'AKT.Cependant, le rôle critique de SPECC1L dans la localisation et la stabilité de la protéine AKT reste à élucider.
De graves défauts dans l'expression de SPECC1L in vivo ont entraîné une augmentation de la coloration du marqueur AJ et une superposition défectueuse du CNCC, ainsi qu'une augmentation de l'apoptose et de la létalité embryonnaire précoce.Des rapports antérieurs ont montré que les mutants de souris présentant des niveaux accrus d'apoptose sont associés à des anomalies du tube neural 44,45,46,47 et à des anomalies cranio-faciales48.Il a été suggéré qu'une mort cellulaire excessive dans les plis neuraux ou les arcs pharyngés pourrait entraîner un nombre insuffisant de cellules nécessaires au bon mouvement morphogénétique 48,49,50.En revanche, nos lignées cellulaires déficientes en SPECC1L avec une expression de SPECC1L modérément réduite ne présentaient que des modifications de l'AJ sans signe de mort cellulaire accrue.Cependant, l'inhibition chimique de la voie PI3K-AKT dans ces cellules Kd a entraîné une augmentation de l'apoptose.Ainsi, une diminution modérée de l’expression ou de la fonction de SPECC1L assure la survie cellulaire.Ceci est cohérent avec l'observation selon laquelle les rares embryons mutants Specc11 qui échappent à l'arrestation à st.E9.5 - peut-être en raison d'une efficacité réduite de capture des gènes - est capable de fermer son tube neural et de s'arrêter plus tard dans son développement, souvent avec des anomalies cranio-faciales (Fig. S3).Cela concorde également avec la rareté des embryons Specc1l hétérozygotes présentant des anomalies cranio-faciales, probablement dues à une efficacité accrue de capture génétique, ainsi qu'avec la découverte chez le poisson zèbre selon laquelle l'un des deux orthologues SPECC1L (specc1lb) provoque des phénotypes embryonnaires tardifs, y compris la perte de mâchoires inférieures et fentes bilatérales51.Ainsi, les mutations hétérozygotes de perte de fonction de SPECC1L identifiées chez des patients humains peuvent entraîner de légères altérations de la fonction de SPECC1L au cours de la morphogenèse cranio-faciale, suffisantes pour expliquer leurs fentes oro-faciales.La régulation des contacts intercellulaires basée sur SPECC1L peut également jouer un rôle dans la palatogenèse et la fusion des arcs pharyngés.D'autres études sur la fonction de SPECC1L aideront à élucider le rôle des contacts intercellulaires temporaires dans le CNCC lors de la fermeture du tube neural dans la motilité des cellules neuroépithéliales et la morphogenèse craniofaciale.
Le contrôle de l'ostéosarcome U2OS et les cellules SPECC1L-kd ont été décrits précédemment (Saadi et al., 2011).Des anticorps contre SPECC1L ont également été caractérisés précédemment (Saadi et al., 2011).Anticorps anti-β-caténine (lapin ; 1 : 1 000 ; Santa Cruz, Dallas, TX) (souris ; 1 : 1 000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosine IIb (1 : 1 000 ; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadhérine (1:1 000 ; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1 : 1 000 ; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1 : 1 000 ; 1 000 ; Aviva Systems Biology, San Diego , Californie), DLX2 (1:1 000 ; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1 : 1 000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1 : 1 000 ; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1 000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 clivée (1 : 1 000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) et β-actine (1 : 2 500 ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) a été utilisé comme décrit..Les filaments d'actine ont été colorés avec de la phalloïdine de rhodamine Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Les cellules témoins U2OS et les cellules SPECC1L-kd ont été cultivées dans du DMEM standard à haute teneur en glucose additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Life Technologies, Carlsbad, CA).Pour les modifications de l'AJ, 2 x 105 cellules ont été ensemencées sur du verre traité avec 0,1% de gélatine porcine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) et observées pour détecter les modifications de la forme des cellules.Les cellules ont été collectées à différents moments indiqués : 4 heures après l'ensemencement (t = 1), 24 heures après l'ensemencement (t = 2), confluence sans changement de forme cellulaire (t = 3), changement de forme cellulaire (t = 4). , 24 h après le changement de forme cellulaire (t = 5) et 48 h après le changement de forme cellulaire (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Pour moduler la voie PI3K-AKT, les cellules ont été cultivées aux concentrations indiquées avec l'inhibiteur de PI3K-AKT, la wortmannine (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ou l'activateur SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Le milieu contenant les produits chimiques était changé quotidiennement.
Des enregistrements image par image ont été réalisés sur des cellules témoins vivantes et KD dans des conditions de culture normales, et des images à contraste de phase ont été collectées toutes les 10 minutes pendant 7 jours.Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope inversé Leica DM IRB contrôlé par ordinateur, équipé d'une platine mécanique et d'un objectif 10 × N-PLAN connecté à une caméra QImaging Retiga-SRV.Pendant l'imagerie, les cultures cellulaires ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2.
Deux lignées cellulaires ES piège à gènes DTM096 et RRH048 du Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ont été utilisées pour générer des lignées de souris déficientes en Specc11, désignées Specc1lgtDTM096 et Specc1lgtRRH046.En bref, des cellules 129/REJ ES ont été injectées dans des blastocystes C57BL6.Les souris mâles chimériques résultantes ont été croisées avec des souris femelles C57BL6 pour identifier la progéniture présentant une coloration du pelage agouti.La présence d'inserts de vecteurs pièges à gènes a été utilisée pour identifier les hétérozygotes.Les souris ont été conservées sur un fond mixte de 129/REJ;C57BL6.L'emplacement du site d'insertion du vecteur piège génétique a été confirmé par RT-PCR, séquençage du génome et complémentation génétique (Figure 1 supplémentaire).Pour retracer la lignée CNCC de souris Specc1lGT doubles hétérozygotes, des souris ROSAmTmG (# 007576) et Wnt1-Cre (# 003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ont été croisées pour produire les allèles ROSAmTmG et Wnt1-Cre dans des embryons mutants Specc1l.Toutes les expériences sur des souris ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du centre médical de l'Université du Kansas.
Les embryons ont été fixés dans (1% de formaldéhyde, 0,2% de glutaraldéhyde, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP-40, 5 mM d'EGTA) pendant 60 minutes à température ambiante.Après fixation dans une solution de coloration X-gal (ferricyanure de potassium 5 mM, ferrocyanure de potassium 5 mM, MgCl2 2 mM, désoxycholate de sodium 0,01 %, NP-40 0,02 %, 1 mg/ml de X-gal), le développement de la coloration a été réalisé à 37°C. .°C en 1 à 6 heures.Les embryons ont été post-fixés dans 4% de PFA et visualisés.
Pour le Western blot, les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse passive (Promega, Fitchburg, WI) complété par un mélange d'inhibiteurs de protéase HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Les lysats ont été traités sur des gels prêts à l'emploi Mini-PROTEAN TGX à 12% de polyacrylamide (Bio-Rad, Hercules, CA) et transférés sur des membranes Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Les membranes ont été bloquées dans du lait à 5 % dans du PBS contenant 0,1 % de Tween.Les anticorps ont été incubés toute la nuit à 4°C ou pendant une heure à température ambiante.Le réactif Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) a été utilisé pour la génération de signaux.Pour l’immunocoloration, les embryons ont été fixés pendant la nuit dans 4 % de PFA/PBS et cryoconservés.Les cryosections de tissus ont été bloquées dans du PBS contenant 1 % de sérum de chèvre normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) et 0,1 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), puis incubées à 4°C dans un incubateur pendant la nuit.avec un anticorps et un anticorps secondaire fluorescent (1:1000) pendant 1 heure à 4°C.Les coupes colorées ont été placées dans du milieu doré ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) et des images plates ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SPE.Chaque immunocoloration a été réalisée sous la forme de trois expériences indépendantes sur des cirossections d'au moins deux embryons mutants.Une expérience représentative est présentée.
Les cellules ont été incubées dans un tampon RIPA modifié (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycérol, 2 mM EDTA et inhibiteur de protéase HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) En bref, les lysats ont été prépurifiés avec des billes magnétiques de protéine G (Life Technologies, Carlsbad, CA), puis incubés pendant une nuit à 4°C avec de la protéine G anti-SPECC1L ou IgG. Des billes de protéine G ont été utilisées pour extraire SPECC1L et un Western blot a été réalisé en utilisant l'anti-SPECC1L ou l'IgG. Anticorps -β-caténine décrit ci-dessus. Les expériences co-IP présentées sont représentatives de quatre expériences indépendantes.
Des cellules cultivées fixes ou des tissus embryonnaires de souris ont été fournis au centre de microscopie électronique du centre médical de l'Université du Kansas.En bref, les échantillons ont été incorporés dans de la résine EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymérisés pendant une nuit à 60 ° C et sectionnés à 80 nm à l'aide d'un ultramicrotome Leica UC7 équipé d'une lame diamantée.Les coupes ont été visualisées à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEOL JEM-1400 équipé d'un canon Lab6 de 100 kV.
Comment citer cet article : Wilson, NR et al.Le déficit en SPECC1L entraîne une stabilité accrue des articulations épissées et une réduction du délaminage des cellules de la crête neurale crânienne.la science.6, 17735 ;est ce que je:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induction et différenciation de la crête neurale.(Springer Science + Business Media ; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et coll.Cellules de la crête neurale crânienne en mouvement : leur rôle dans le développement cranio-facial.Journal américain de génétique médicale.Partie A 155A, 270-279, est ce que je:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia : sa croissance et son développement sur 20 ans.Pédiatre.pathologie.laboratoire.médecine.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU et Noten MM Percée dans la génétique des fentes oro-faciales.Tendances en médecine moléculaire 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. et Riley, FM Mécanismes moléculaires de la migration et de la structuration des cellules de la crête neurale crânienne au cours du développement cranio-facial.Développement 137, 2605-2621, doi : 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH et Murray, JK Fente labio-palatine : comprendre les influences génétiques et environnementales.commentaire naturel.Génétique 12, 167-178, doi : 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et coll.Morphogenèse anormale de la peau, des membres et de la région cranio-faciale chez des souris déficientes en facteur 6 régulant l'interféron (Irf6).Genette Nationale.38, 1335-1340, est ce que je : 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Les mutations dominantes de GRHL3 provoquent le syndrome de van der Waord et altèrent le développement du périderme buccal.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi : 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ et Juriloff, DM Mettre à jour la liste des mutants de souris présentant des défauts de fermeture du tube neural et progresser vers une compréhension génétique complète de la fermeture du tube neural.Enquête sur les malformations congénitales.Partie A, Tératologie clinique et moléculaire 88, 653-669, doi : 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. La signalisation PDGFRalpha médiée par PI3K régule la survie et la prolifération dans le développement du squelette via une voie intracellulaire dépendante de p53.Développement génétique 28, 1005-1017, doi : 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND et Murdoch, JN Disheveled : Relation entre l'expansion convergente et la fermeture du tube neural.Tendances en neurologie.26, 453-455, est ce que je : 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).